Page 163 - 《广西植物》2026年第5期
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５ 期 鲁璇等: 红光调控有柄石韦叶片黄酮代谢的多组学解析 ８ ９ ５
图 １ 不同光质下培育的有柄石韦
Ｆｉｇ. １ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｐｙｒｒｏｓｉａ ｐｅｔｉｏｌｏｓａ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｑｕａｌｉｔｉｅｓ
后ꎬ每重复随机取 １０ 片健康无病叶片混合ꎬ无菌 ( 北 京 ) 有 限 公 司 ] 提 取 各 样 品 总 ＲＮＡꎬ 使 用
水冲洗干净后放进灭菌离心管用液氮速冻ꎬ贮存 Ｑｕｂｉｔ ４. ０ 荧 光 计 ( Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ ＵＳＡ ) 和
在－８０ ℃ 超低温冰箱ꎬ进行代谢组和转录组测定ꎮ Ｑｓｅｐ４００ 生 物 分 析 仪 ( Ｂｉｏｐｔｉｃꎬ Ｃｈｉｎａ) 检 测 ＲＮＡ
１.３ 代谢组测序与分析 浓度及完整性ꎮ 按照试剂盒说明书使用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ
将有柄石韦叶片真空冷冻干燥后研磨至粉末 的 ＮＥＢＮｅｘｔ ® ＵｌｔｒａＴＭ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ 进行
状ꎬ加入－２０ ℃预冷的 ７０％甲醇水内标提取液进行 文库构建ꎬ使用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 高通量测序平台对 ｃＤＮＡ
提取ꎬ离心过滤后用于 ＵＰＬＣ￣ＭＳ / ＭＳ 分析ꎮ 色谱柱 文库进行测序ꎮ 通过比较 ＷＬ 和 ＲＬꎬ分析有柄石
为 Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＢ￣Ｃ (１.８ μｍꎬ２.１ ｍｍ × １００ ｍｍ)ꎮ 流 韦经 不 同 光 质 处 理 后 的 基 因 表 达 变 化ꎮ 使 用
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动相 Ａ 为超纯水(加入 ０.１％甲酸)ꎬＢ 为乙腈(加入 ＦａｓｔＰ 软件进行转录组数据质量控制得到高质量
０.１％甲酸)ꎻ流速为 ０.３５ ｍＬｍｉｎ ꎻ柱温 ４０ ℃ꎻ进 测序数据ꎬ使用 Ｂｕｓｃｏ 软件对转录本进行完整性
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样量 ２ μＬꎮ 样品质谱信号采集采用正负离子扫描 评估并 作 为 后 续 分 析 的 参 考 序 列ꎮ 利 用 Ｃｏｒｓｅｔ
模式ꎬ质量扫描范围为 ７０ ~ １ ０５０ ｍ/ ｚꎮ 基于武汉迈 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｇｉｔｈｕｂ. ｃｏｍ / Ｏｓｈｌａｃｋ / Ｃｏｒｓｅｔ) 对转录本进
维代谢生物科技股份有限公司自建数据库 ＭＷＤＢ 行层次聚类ꎬ得到最长 Ｃｌｕｓｔｅｒ 序列作为 Ｕｎｉｇｅｎｅ
(ｍｅｔｗａｒｅ ｄａｔａｂａｓｅ)和代谢物公共数据库进行注释ꎬ 进行 后 续 分 析ꎮ 基 于 ＮＲ、 ＫＯＧ / ＣＯＧ、 ｔｒＥＭＢＬ、
代谢物定性主要依据保留时间、母离子信息及 ＭＳ / Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｏｒｔ、ＧＯ 和 ＫＥＧＧ 数 据 库 对 组 装 完 成 的
ＭＳ 碎片谱与 ＭＷＤＢ 谱库/ 公共数据库的匹配结果ꎮ Ｕｎｉｇｅｎｅ 进行功能注释ꎮ 使用 ＤＥＳｅｑ２ Ｒ 软 件 包
定量采用三重四级杆质谱 ＭＲＭ 模式ꎬ以峰面积积 对 ＷＬ 和 ＲＬ 组间基因表达量进行差异分析ꎬ采
分(内标校正) 进行相对定量ꎮ 采用 ＳＩＭＣＡ１４.１ 软 用 Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ￣Ｈｏｃｈｂｅｒｇ 作 为 多 重 检 验 校 正 方 法ꎬ
件进行 主 成 分 分 析 ( ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ 得到错 误 发 现 率 ( ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅꎬ ＦＤＲ) ꎮ 满
ＰＣＡ) 和正交 偏 最 小 二 乘 法 判 别 分 析 ( ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ 足 ｜ ｌｏｇ ＦＣ ｜ ≥１ 且 ＦＤＲ<０.０５ 的基因被认为是处
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ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ￣ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＯＰＬＳ￣ＤＡ)ꎬ 理间的差异表达基因( ＤＥＧｓ) ꎮ
采用 Ｚ￣ｓｃｏｒｅ 对过滤后的数据进行标准化处理ꎮ 基 １.５ 实时荧光定量 ＰＣＲ 验证
于 ＯＰＬＳ￣ＤＡ 结果ꎬ结合差异倍数(ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅꎬＦＣ) 为验证转录组数据准确性ꎬ随机选择转录组
®
和 变 量 重 要 性 投 影 ( ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ 中的 ＤＥＧｓ 进行 ＰＣＲ 验证ꎮ 使用 Ｅａｓｔｅｐ Ｓｕｐｅｒ 总
ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎꎬ ＶＩＰ) 筛选差异积累代谢物( ＤＡＭｓ)ꎬ即 ＲＮＡ 提取试剂盒(Ｐｒｏｍｅｇａꎬ美国)提取处理组和对
ＶＩＰ≥１ 和 ＦＣ≥２ 或 ＦＣ≤０.５ 为 ＤＡＭｓꎮ 鉴定出的 照组有柄石韦叶片的 ＲＮＡꎬ使用 Ｑｕａｎｔｕｓ 荧光计
ＴＭ
ＤＡＭｓ 由 ＫＥＧＧ 数据库进行检索并映射到 ＫＥＧＧ (Ｐｒｏｍｅｇａꎬ美国)测定 ＲＮＡ 纯度ꎬ琼脂糖凝胶电泳
Ｐａｔｈｗａｙ 数据库ꎬ以获得其 ＫＥＧＧ 代谢通路信息ꎮ 检测 ＲＮＡ 的 完 整 性ꎮ 按 照 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＦＡＳＴ ＲＴ
１.４ 转录组测序与分析 ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ( ＴａＫａＲａꎬ日本) 试剂
使用 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ [ 天根生化科技 盒说明书操作合成 ｃＤＮＡꎬｑＲＴ￣ＰＣＲ 使用 ＣｈａｍＱ
