Page 72 - 《广西植物》2026年第9期

１ ５ ０ ８ 广 西 植 物 ４６ 卷
１４.７５ μＬꎬ总体积 ２５ μＬꎮ 反应程序:９８ ℃ 预变性 色谱分析采用 Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ⅱ ＨＰＬＣ
３０ ｓꎻ９８ ℃ 变性 １０ ｓꎬ退火 ３０ ｓ(退火温度根据引物 系统ꎬ配备反相 Ｗｅｌｃｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＰ￣Ｃ 色谱柱(２５０
１８
而定)ꎬ７２ ℃ 延伸 ４５ ｓꎬ循环 ３５ 次ꎻ６８ ℃ 终延伸 ２ ｍｍ × ４.６ ｍｍꎬ５ μｍ)ꎮ 流动相为 ０.１％磷酸水溶液
ｍｉｎꎬ４ ℃ 保存ꎮ (Ａ) －乙腈(Ｂ)(９９ ∶ １)ꎬ线性梯度洗脱ꎬ总流速 １
将 ＰＣＲ 产物进行 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ条 ｍＬｍｉｎ ꎮ 梯度条件:０ ~ ３ ｍｉｎꎬ１％ 乙腈ꎻ３ ~ １２
￣１
带大小正确ꎬ进行回收纯化ꎬ并将纯化产物送生工 ｍｉｎꎬ１％ ~ ４％乙腈ꎻ１２ ~ ２５ ｍｉｎꎬ乙腈升至 ５％ꎻ２５ ~

生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ ３２ ｍｉｎꎬ乙腈升至 １０％ꎮ 进样量为 １０ μＬꎬ检测波
利用测序获得的 ＤＮＡ 序列在 ＮＣＢＩ 上进行同 长为 ２０３ ｎｍꎬ柱温为 ３５ ℃ ꎬ总分析时间为 ３２ ｍｉｎꎮ

源比对( ｈｔｔｐｓ: / / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｂｌａｓｔ. ｃｇｉ)ꎬ 对照品与样品高效液相色谱图见图 １ꎮ
获取地黄属物种地黄、天目地黄、湖北地黄、裂叶 １.６.２ 方法学考察 精密称取适量梓醇、益母草

地黄、高地黄、茄叶地黄和黄花地黄的 ＩＴＳ 和 Ｒ２５５ 苷、桃叶珊瑚苷、地黄苷 Ｄ 和地黄苷 Ａ 对照品ꎬ分
序列ꎬ并获取崖白菜(Ｔｒｉａｅｎｏｐｈｏｒａ ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ) 的同源 别用适量甲醇( 色谱纯) 制成系列标准品溶液ꎬ其
序列为外类群ꎮ 对测序序列和下载的 ＤＮＡ 序列 中益母草苷、桃叶珊瑚苷、地黄苷 Ｄ 和地黄苷 Ａ 对
利用 在 线 软 件 ＭＡＦＦＴ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｅｂｉ. ａｃ. ｕｋ / 照品的标准品溶液均为 ６ 种不同质量浓度( １０、
ｊｄｉｓｐａｔｃｈｅｒ / ｍｓａ / ｍａｆｆｔ)进行多序列比对ꎬ比对结果 ５０、１００、２５０、５００、１ ０００ μｇｍＬ )ꎬ梓醇对照品的
￣１
通过 ＭＥＧＡ ｖ６.０ 采用邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ) 标准品 溶 液 的 质 量 浓 度 在 此 基 础 上 增 设 １ ５００
进行进化分析ꎬｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值选择 １ ０００ 次ꎬ构建系 μｇｍＬ ꎬ按照“１.６.１” 项的方法进行测定ꎮ 以标
￣１
￣１
统进化树ꎮ 准品质量 浓 度 ( Ｘꎬ μｇ ｍＬ ) 为 横 坐 标ꎬ 峰 面 积
(Ｙ)为纵坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ得到回归方程ꎮ 结
表 １ 鉴定金黄花地黄核基因序列所用引物信息 果(表 ２)表明ꎬ梓醇在浓度 １０ ~ １ ５００ μｇｍＬ 的
￣１
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ
范围内与峰面积呈现良好的线性关系ꎬ益母草苷、
ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ ｆ. ａｕｒｕｍ
桃叶珊瑚苷、地黄苷 Ｄ、地黄苷 Ａ 均在浓度 １０ ~
￣１
熔解温度 １ ０００ μｇｍＬ 的范围内与峰面积呈现良好的线
引物名称 引物序列 (５′－３′) Ｍｅｌｔｉｎｇ
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ 性关系ꎮ 并且ꎬ梓醇、益母草苷、桃叶珊瑚苷、地黄
(℃ )
苷 Ｄ 和地黄苷 Ａ ５ 种成分精密度试验、重复性试
验、稳 定 性 试 验 的 ６ 次 重 复 的 相 对 标 准 偏 差
ＩＴＳ１＿Ｆ ＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧＡ ５８.８
(ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎꎬＲＳＤ)均小于 ２.００％ꎬ加
ＩＴＳ１＿Ｒ ＴＣＧＡＡＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣ ５８.４
样回收率均大于 ９５％ꎬ说明方法学考察结果良好ꎮ
ＩＴＳ２＿Ｆ ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ ５１.７
１.７ 遗传分析
ＩＴＳ２＿Ｒ ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ ５０.７
在盛花期ꎬ选择金黄花地黄和地黄栽培品种
ＨＦ 的健康植株进行杂交ꎬ选取 ＨＦ 的待开放花蕾
Ｒ２５５￣１＿Ｆ ＧＡＣＡＧＡＡＡＣＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧ ５５.８
进行人工去雄ꎬ以金黄花地黄当日开花的雄蕊给
Ｒ２５５￣１＿Ｒ ＧＧＧＡＣＡＣＧＴＡＧＧＣＴＴＣＡＡＧＡＴ ５７.０
ＨＦ 雌蕊授粉ꎬ授粉后套袋隔离ꎬ并在 １ 周后观察
Ｒ２５５￣２＿Ｆ ＡＴＣＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＴＣＣＴ ５３.０
结实情况ꎬ在杂交蒴果成熟后收获杂交种 Ｆ ( ＨＦ /
Ｒ２５５￣２＿Ｒ ＴＣＴＡＣＴＧＡＴＧＴＧＡＧＣＣＧＴＴＡＴ ５２.５ １
ｆ. ａｕｒｕｍ)ꎮ 杂交种 Ｆ 种植后观察其花冠颜色ꎬ检
１
测花冠中的总花青素苷含量ꎮ 之后以金黄花地黄
１.６ 环烯醚萜苷类成分含量测定 为父本与 Ｆ 代植株进行回交ꎬ选取 Ｆ 代健康植株
１ １
１.６.１ 金黄花地黄环烯醚萜苷类成分含量测定 待开放花蕾进行人工去雄ꎬ以金黄花地黄当日开
提取方法:分别称取 ０.８００ ０ ｇ 金黄花地黄的块根 花的雄蕊给 Ｆ 代植株授粉ꎬ授粉后套袋隔离ꎬ获得
１
和叶片粉末ꎬ加入 ５０ ｍＬ ２５％甲醇( 分析纯) 超声 的种 子 即 为 ＢＣ Ｆ 代 ( ＨＦ / ｆ. ａｕｒｕｍ / / ｆ. ａｕｒｕｍ)ꎮ
１ １
￣１ 观察回交种子种植后 ＢＣ Ｆ 代不同单株的花色ꎬ测
４５ ｍｉｎꎬ４ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎꎬ将上清液过滤ꎮ
１ １
取 ２０ ｍＬ 滤液于蒸发皿中蒸干ꎬ用流动相定容至 定花冠总花青素苷的含量ꎬ并计算紫花植株和金
１０ ｍＬꎬ０.２２ μｍ 微孔滤膜滤过即为待测液ꎮ 黄花植株的分离比ꎮ