Page 97 - 《广西植物》2020年第10期

１ ４ ８ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
１.２ 形态测量和统计方法 表 １ 用于 ＩＴＳ 序列扩增的植物材料及其来源
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｓｏｕｒｃｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
应 用 ＩｍａｇｅＪ ( ｈｔｔｐ: / / ｉｍａｇｅｊ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｉｊ/ ｉｎｄｅｘ.
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｈｔｍｌ)测量来自不同采集地的 ４ 种类型植物( 半蒴
物种 采集地
苣苔 ４９ 株、永福半蒴苣苔 ３９ 株、翅茎半蒴苣苔 ３６
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｐｌａｃｅ
株、金钟山居群 ３８ 株) 的茎宽及叶长、叶宽ꎬ确定
半蒴苣苔 Ｈｅｍｉｂｏｅａ ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 江西上饶 Ｓｈａｎｇｒａｏꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ
这些数量性状的变化范围和平均值ꎮ 用 Ｇｒａｐｈｐａｄ
半蒴苣苔 Ｈ. ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 浙江杭州 Ｈａｎｇｚｈｏｕꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ
Ｐｒｉｓｍ(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.ｇｒａｐｈｐａｄ.ｃｏｍ / ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｓｏｆｔｗａｒｅ
半蒴苣苔 Ｈ. ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 浙江临安 Ｌｉｎ’ａｎꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ
/ ｐｒｉｓｍ / )绘制对应的箱式图ꎮ
半蒴苣苔 Ｈ. ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 湖南长德 Ｃｈａｎｇｄｅꎬ Ｈｕｎａｎ
１.３ 叶片显微结构测量方法
半蒴苣苔 Ｈ. ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 湖南长德 Ｃｈａｎｇｄｅꎬ Ｈｕｎａｎ
１.３.１ 材料 分别选取半蒴苣苔 ６ 株、永福半蒴苣
半蒴苣苔 Ｈ. ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 湖北神农架 Ｓｈｅｎｎｏｎｇｊｉａꎬ Ｈｕｂｅｉ
苔 ６ 株、翅茎半蒴苣苔 ５ 株、金钟山居群 ６ 株的成
半蒴苣苔 Ｈ. ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 湖北宜昌 Ｙｉｃｈａｎｇꎬ Ｈｕｂｅｉ
熟叶片ꎬ进行显微结构测量ꎮ
半蒴苣苔 Ｈ. ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
１.３.２ 叶片横切的处理方法 将叶片沿中脉横切
半蒴苣苔 Ｈ. ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
为 ５ ｍｍ × ５ ｍｍꎬ用 １％的番红溶液染色ꎬ制片ꎬ光
永福半蒴苣苔 Ｈ. ｙｏｎｇｆｕｅｎｓｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
学显微镜观察并拍照ꎮ
永福半蒴苣苔 Ｈ. ｙｏｎｇｆｕｅｎｓｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
１.３.３ 叶表皮的处理方法 取完整成熟叶片ꎬ洗
永福半蒴苣苔 Ｈ. ｙｏｎｇｆｕｅｎｓｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
净ꎬ连同中脉( 便于判断上、下表皮) 将叶片剪成
永福半蒴苣苔 Ｈ. ｙｏｎｇｆｕｅｎｓｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
１.５ ｃｍ × １.５ ｃｍ 左右的小块ꎻ加适量 ＫＯＨꎬ用沸水
永福半蒴苣苔 Ｈ. ｙｏｎｇｆｕｅｎｓｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
煮泡数分钟后( 时间因材料而定)ꎬ将材料投入冷
翅茎半蒴苣苔 Ｈ. ｐｔｅｒｏｃａｕｌｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
水浸泡数分钟ꎻ倒去冷水ꎬ放入 ３０％的 ＮａＣｌＯ 溶液
翅茎半蒴苣苔 Ｈ. ｐｔｅｒｏｃａｕｌｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
中浸泡至叶片发白后取出ꎬ蒸馏水冲洗后ꎬ撕取叶
翅茎半蒴苣苔 Ｈ. ｐｔｅｒｏｃａｕｌｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
片的上下表皮ꎬ用毛笔去掉叶肉组织ꎻ用 １％的番
翅茎半蒴苣苔 Ｈ. ｐｔｅｒｏｃａｕｌｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
红溶液染色ꎬ制成装片ꎬ光学显微镜观察并拍照ꎮ
翅茎半蒴苣苔 Ｈ. ｐｔｅｒｏｃａｕｌｉｓ 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
１.４ 基于 ＩＴＳ 序列的系统发育关系重建和单倍型
金钟山居群 Ｈｅｍｉｂｏｅａ ｓｐ. 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
网络图构建
金钟山居群 Ｈｅｍｉｂｏｅａ ｓｐ. 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
分别采集不同地点的半蒴苣苔、永福半蒴苣
金钟山居群 Ｈｅｍｉｂｏｅａ ｓｐ. 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
苔、翅茎半蒴苣苔和金钟山居群各 ９、５、５、５ 份叶
金钟山居群 Ｈｅｍｉｂｏｅａ ｓｐ. 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
片ꎬ利用硅胶干燥保存( 具体材料来源见表 １)ꎮ
金钟山居群 Ｈｅｍｉｂｏｅａ ｓｐ. 广西桂林 Ｇｕｉｌｉｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
采用 ＣＴＡＢ 法(Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｄｏｙｌｅꎬ１９８７) 提取总 ＤＮＡꎮ
ＩＴＳ 引 物 的 选 择、 ＰＣＲ 扩 增 等 参 考 Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ.
(２０１７) 的实验流程ꎮ 本研究获得的原始序列在 对ꎬ在 ＢｉｏＥｄｉｔ( Ｈａｌｌꎬ１９９９) 软 件 中 检 查 和 人 工 校
ＳＥＱＭＡＮ 软件( Ｓｗｉｎｄｅｌｌ ＆ Ｐｌａｓｔｅｒｅｒꎬ１９９７) 中进行 正ꎻ用 ｊＭｏｄｅｌＴｅｓｔ２.１.７( Ｐｏｓａｄａꎬ２００８) 软件计算并
剪切拼接和校正ꎬ共获得 ＩＴＳ 序列 ２４ 条ꎮ 把这些 选择最优模型 ＧＴＲ＋Ｇꎬ选择最大似然法构建系统
新获得序列加入最新已发表的半蒴苣苔 ＩＴＳ 矩阵 发育树ꎻ使用 ＲＡｘＭＬ７.２.６(Ｓｔａｍａｔａｋｉｓꎬ２００６) 软件ꎬ
中(Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１９)ꎬ最终矩阵包括半蒴苣苔属已知 设置 １ ０００ 次重复的自展分析( ｂｏｏｔｓｔｒａｐꎬＢＳ)ꎬ评
２２ 个物种及 ２ 种新类型序列共 ５７ 条ꎮ 选取小石 估各节点的可靠性ꎮ
蝴 蝶 ( Ｐｅｔｒｏｃｏｓｍｅａ ｍｉｎｏｒ )、 小 叶 吊 石 苣 苔 选择适用于单倍型分析 的 半 蒴 苣 苔 复 合 群
ＩＴＳ 矩阵( 半蒴苣苔 １８ 条、永福半蒴苣苔 ５ 条、翅
( Ｌｙｓｉｏｎｏｔｕｓ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌｕｓ )、 大 苞 苣 苔 ( Ａｎｎａ
茎半蒴苣苔 ６ 条、金钟山居群 ５ 条) 共 ３４ 条序列ꎻ
ｓｕｂｍｏｎｔａｎａ)作为外类群(Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ
利用 ＭＵＳＣＬＥ ３.８.３１(Ｅｄｇａｒꎬ２００４)软件进行比 利用 ＤｎａＳＰ ｖ５(Ｌｉｂｒａｄｏ ＆ Ｒｏｚａｓꎬ２００９)软件分析半