Page 15 - 《广西植物》2020年第3期

３ 期 李蜜等: 海南西海岸红树林伴生植物内生放线菌多样性及其延缓衰老活性初筛 ２ ９ ５

ＰＣＲ 反应条件:９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎬ后进行 ３０ 个循
表 １ 样品采集信息
环(９４ ℃ ３０ ｓꎬ５５ ℃ ３０ ｓꎬ７２ ℃ ９０ ｓ)ꎬ循环结束
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ
后ꎬ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 产物用 １％ 琼脂糖凝
样品编号 经纬度 胶电泳检测ꎬ利用 Ｂｉｏ￣ＲＡＤ 凝胶成像仪观察电泳
植物名称 植物组织
Ｓａｍｐｌｅ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
Ｐｌａｎｔ ｎａｍｅ Ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ 结果ꎮ Ｇｅｌ Ｌｏｇｉｃ ２２００ Ｐｒｏ 凝胶成像仪检验条带合
ｃｏｄｅ ａｎｄ ｌａｔｉｔｕｄｅ
格后委托上海美吉生物医药技术有限公司广州分
Ｈ１ 海马齿 叶、茎 １０９°３３″５０′Ｅ、
Ｓｅｓｕｖｉｕｍ Ｌｅａｆ ａｎｄ ｓｔｅｍ １９°５１″２７′Ｎ 公司进行测序ꎮ 测序结果经 ＤＮＡ Ｓｔａｒ 软件整理ꎬ
ｐｏｒｔｕｌａｃａｓｔｒｕｍ
利用数据库 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｅｚｔａｘｏｎ.ｏｒｇ / )
Ｈ２ 厚藤 花、茎、叶 １０９°３３″５０′Ｅ、
Ｉｐｏｍｏｅａ ｐｅｓ￣ｃａｐｒａｅ Ｂｌｏｓｓｏｍꎬ ｓｔｅｍ １９°５１″２７′Ｎ (Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００９) 及 Ｂｌａｓｔ 网站进行在线比对ꎻ对
ａｎｄ ｌｅａｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列进行相似性比对搜索ꎮ 将纯化
Ｈ３ 鱼藤 花、茎、叶 １０９°５９″３７′Ｅ、
Ｄｅｒｒｉｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ Ｂｌｏｓｓｏｍꎬ ｓｔｅｍ １５°５５″０７′Ｎ 好的菌株制成 ２０％(Ｖ / Ｖ)甘油管保存于－８０ ℃ 超
ａｎｄ ｌｅａｆ
低温冰箱中ꎮ
Ｈ４ 曼陀罗 花、茎、叶、胚轴 １０９°３３″５０′Ｅ、
Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ Ｂｌｏｓｓｏｍꎬ ｓｔｅｍꎬ １９°５１″２７′Ｎ １.２.３ 放线菌粗提物的制备 参考覃媚等(２０１６)
ｌｅａｆ ａｎｄ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
的方法ꎬ从 ＩＳＰ２ 固体培养基上挑取 ２６ 株对数生长
Ｈ５ 苦郎树 茎、叶、胚轴 １０９°５９″３７′Ｅ、
Ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ ｉｎｅｒｍｅ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆ １９°５５″０７′Ｎ 期的菌丝接种到 ２００ ｍＬ ＩＳＰ２ 液体培养基中ꎬ在恒
ａｎｄ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
温振荡培养箱中 ２８ ℃ 、１８０ ｒｍｉｎ 发酵 ７ ｄꎻ离心
￣１
Ｈ６ 猩猩草 花、茎、叶 １０９°３３″５０′Ｅ、
Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｃｙａｔｈｏｐｈｏｒａ Ｂｌｏｓｓｏｍꎬ ｓｔｅｍ １９°５１″２７′Ｎ 收集发酵液ꎬ发酵液用乙酸乙酯萃取( 用符号 Ｅ 表
ａｎｄ ｌｅａｆ
示)ꎬ取上层乙酸乙酯层浓缩备用ꎻ菌体(用符号 Ｔ
Ｈ７ 弯枝黄檀 茎、叶、胚轴 １０９°３３″５０′Ｅ、
表示)用丙酮破壁后甲醇萃取浓缩干燥ꎬ收集粗提
Ｄａｌｂｅｒｇｉａ ｃａｎｄｅｎａｔｅｎｓｉｓ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆ １９°５１″２７′Ｎ
ａｎｄ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
物ꎬ用于线虫抗衰老活性的初步筛选ꎮ
１.２.４ 线虫的寿命实验 参考 Ｌａｋｏｗｓｋｉ ＆ Ｈｅｋｉｍｉ
杂质ꎬ分别选取完整无病虫害的花、茎、叶、胚轴进 (１９９８)的方法ꎬ检测 ２６ 株放线菌发酵粗提物是否
行表面消毒ꎬ先用 ５％的次氯酸钠溶液浸泡 ８ ｍｉｎꎬ 具有延缓线虫衰老的作用ꎮ 将线虫涂布于含有
ＯＰ５０ 的 ＮＧＭ(ｎｅｍａｔｏｄｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ)固体培养基
无菌 水 冲 洗 ３ 次ꎻ 再 用 ７５％ 的 酒 精 溶 液 浸 泡 ５
ｍｉｎꎬ无菌水冲洗 ３ 次ꎮ 分离培养基参考李飞娜等 上ꎬ置于 ２０ ℃ 恒温培养箱培养约 ４８ ｈ 后可见 Ｌ４
(２０１７)ꎮ 分别取少量表面消毒后的植物材料约 ２ 期成 熟 线 虫ꎬ 此 时 线 虫 可 用 于 实 验 ( Ｂｒｅｎｎｅｒꎬ
ｇ 于研钵中充分研磨ꎬ吸取 ２ ｍＬ 无菌水与研磨后 １９７４)ꎮ ＮＧＭ 固体培养基( 黄正杰等ꎬ２０１３):Ｎａｃｌ
的浆液混匀ꎬ此浓度液作为样品原液ꎬ再依次稀释 ３ ｇꎬ蛋白胨 ２.５ ｇꎬＡｇａｒ １７ ｇꎬ去离子水 ９７５ ｍＬꎮ
到 １０ 组织悬液ꎮ 分别取 １００ μＬ １０ 组织悬液涂 １２１ ℃ ꎬ２０ ｍｉｎꎬ灭菌后ꎬ待培养基温度降至 ５５ ℃ ꎬ
￣４
￣４
布在 ９ 种 分 离 培 养 基 ( ＡＧＧ、 Ｍ４、 Ｍ５、 Ｍ７、 Ｍ９、 依次加入 ＣａＣｌ １ ｍＬꎬＭｇＳＯ １ ｍＬꎬＫ ＰＯ ２５ ｍＬꎬ５
３
４
２
４
Ｍ１０、ＩＳＰ７、ＩＳＰ３ 和 Ｍ１１)上ꎬ样品原液置于 ４ ℃ 冰 ｍｇｍＬ 胆固醇 １ ｍＬꎬ混匀后ꎬ倒入一次性平板ꎬ
￣１
箱暂存ꎮ 平板至少放置 １ ｄ 后可用或置于 ４ ℃ 下一个月内
１.２.２ 菌 株 的 分 离 纯 化 及 保 藏 参 考 吴 家 法 等 使用完毕ꎮ
(２０１７)的方法ꎬ分离平板置于 ２８ ℃ 恒温培养箱培 线虫的同期化:取传代后线虫用约 １０ ｍＬ 的
养 ２ ~ ８ 周通过形态观察ꎬ挑选质地致密程度较高ꎬ Ｍ９ 缓冲液( Ｎａ ＨＰＯ ６ ｇꎬＫＨ ＰＯ ３ ｇꎬ ＮａＣｌ ５ ｇꎬ
２ ４ ２ ４
边缘内陷明显的放线菌菌落在 ＩＳＰ２ 培养基上进行 ＭｇＳＯ ７Ｈ Ｏ ０.２５ ｇꎬ去离子水 １ Ｌ) 重复清洗到
４ ２
三区划线纯化ꎬ如有杂菌则进行二次纯化或多次 １５ ｍＬ 离心管中ꎬ用微孔滤膜过滤ꎬ取下层液体备
纯化ꎬ直至得到单一纯净的菌落ꎬ并记录菌落数及 用ꎮ １００ ｍＬ 大肠杆菌发酵液离心ꎬ去掉上清液ꎬ备
菌落的形态特征ꎮ 获得纯菌株采用 Ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 法 用ꎮ 取含有大量虫卵的液体滴加于涂布有 ＯＰ５０

(周双清等ꎬ２０１０)提取基因组 ＤＮＡꎻ参照 Ｗａｌｓｈ ｅｔ 的 ＮＧＭ 平板中心ꎬ平板中还需加入一定量的 ＦＤＵ
ａｌ.(１９９１)的方法进行 ＰＣＲ 梯度扩增ꎬ扩增引物为 抑制线虫后代的产生ꎮ

通 用 引 物 ２７Ｆ ( ５′￣ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ￣ 寿命实验:将菌体粗提物样品浸膏溶解于 ２％
￣１
３′) 和 １４９２Ｒ ( ５′￣ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ￣３′)ꎮ ＤＭＳＯ 中ꎬ终浓度为 １００ ｍｇＬ (实验组)ꎬ阿维菌