Page 42 - 《广西植物》2020年第3期
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３ ２ ２                                 广  西  植  物                                         ４０ 卷
   已鉴定化合物对于人体健康保健方面如延缓衰老                             １.２ 红树根系土壤放线菌多样性实验
   活性则鲜有报道ꎮ 本研究对红树根系土壤放线菌                            １.２.１ 培养基配方  分离用固体培养基:参考李家
   多样性进行分析ꎬ并通过初步筛选获得具有延缓                             怡 等 ( ２０１７ ) 方 法 采 用 ＡＧＧ、 Ｍ４、 Ｍ５、 Ｍ７、 Ｍ９、
   衰老表型的放线菌菌株ꎬ为后期挖掘具有延缓衰                             Ｍ１０、Ｍ１１、ＩＳＰ７ 和 ＩＳＰ３ 共 ９ 种分离培养基ꎬ培养
   老活性的新化合物提供重要的菌种资源ꎮ                                基详细配方见参考文献ꎮ
                                                         纯化及保藏培养基:改良 ＩＳＰ２ 固体培养基ꎬ包
   １  材料与方法                                          括酵母提取物 ２.０ ｇꎬ麦芽提取物 ２.０ ｇꎬ葡萄糖 ２.０

                                                     ｇꎬ琼脂 ２０.０ ｇ 和海水 １ ０００ ｍＬꎮ
   １.１ 材料                                                发酵培养基:改良 ＩＳＰ２ 液体培养基ꎮ
   １.１.１ 红树林根系土壤样品  ２０１７ 年 ７ 月从海南                    １.２.２ 红树根系土壤样品的处理方法  参考李菲
   西海岸共采集四种真红树林植物根系土壤样品 ７                            等(２０１８)的方法ꎬ挑除根系土壤样品表面的杂质ꎬ
   份ꎬ样品信息如表 １ 所示ꎮ 用灭菌铲沿每种红树                          取红树植物根须表面附着的土壤 ２.０ ｇ 装于含有
   根围挖取深度为 ５ ｃｍ 的土壤样品ꎬ同一种红树植                         石英砂和 ２０ ｍＬ 无菌水的锥形瓶中ꎬ于摇床中充
   物样品的取样地点距离均大于 １００ ｍꎬ土壤样品保                         分摇匀ꎬ制成 １０ 、１０ 稀释液ꎮ 取两种稀释液各
                                                                    ￣２
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   存于采样冰盒中并于 ２４ ｈ 内送回实验室进行菌株                         ０.２ ｍＬꎬ分别涂布于 ９ 种分离培养基上ꎬ置于恒温
   的分离实验ꎮ                                            培养箱 ２８ ℃ 下倒置培养 ２ ~ ８ 周ꎻ从涂布培养基中
                                                     挑选单一菌落ꎬ采用三区划线法于 ＩＳＰ２ 培养基上
                 表 １  样品采集信息
                                                     进行分离纯化ꎬ得到单一纯净的菌落ꎬ编号并记录
         Ｔａｂｌｅ １  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ
                                                     菌落的形态特征及菌落数ꎮ 将纯化好的菌株保藏
    样品编号    土壤样品                     经纬度             于 ２０％(Ｖ / Ｖ)无菌甘油管ꎬ－８０ ℃ 冰箱保存备用ꎮ
     Ｃｏｄｅ ｏｆ                         Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ ａｎｄ
            Ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅ
     ｓａｍｐｌｅ                          ｌａｔｉｔｕｄｅ        １.２.３ １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列的系统发育学分析  放
      １－３   红海榄土壤                    １０９°５９′３７″ Ｅ、   线菌基因组提取采 用 Ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 法 ( 周 双 清 等ꎬ
                                                     ２０１０)通过梯度 ＰＣＲ 扩增得到 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序
            Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ  １９°５５′０７″ Ｎ
      １－４   红海榄土壤                    １０９°５９′３７″ Ｅ、   列(Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ１９９１)ꎬ利用琼脂糖凝胶电泳初步
            Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ  １９°５５′０７″ Ｎ
     １－１４   红海榄土壤                    １０９°３３′５０″ Ｅ、   评价目的条带大小及扩增质量ꎬ切胶回收目的条
            Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ  １９°５１′２７″ Ｎ
                                                     带并委托上海美吉生物医药技术有限公司广州分
      ２－１   桐花树土壤                    １０９°５９′３７″ Ｅ、
            Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ １９°５５″０７″ Ｎ  公司进行测序分析ꎮ
      ２－２   白骨壤土壤                    １０９°５９′３７″ Ｅ、       测序结果利用 ＤＮＡ Ｓｔａｒ 软件处理ꎬ所得到 １６Ｓ
            Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ  １９°５５′０７″ Ｎ
                                                     ｒＲＮＡ 基因 序 列 通 过 数 据 库 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ ( ｈｔｔｐｓ: / /
      ２－３   白骨壤土壤                    １０９°５９′３７″ Ｅ、
                                                     ｗｗｗ.ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ.ｎｅｔ/ )(Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)进行相似
            Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ  １９°５５′０７″ Ｎ
      ７－７   红树土壤                     １０９°３３′５０″ Ｅ、   性搜索和在线比对ꎬ获得相似性最高且有效发表
            Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ  １９°５１′２７″ Ｎ
                                                     的典型菌株ꎬ并以此作为参比对象ꎮ
                                                     １.３ 红树根系土壤放线菌活性实验
   １.１.２ 线虫样品  ＯＰ５０ 大肠杆菌(ＯＰ５０ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ            １.３.１ 红树根系土壤放线菌粗提物的制备  参考
   ｃｏｌｉ) 和 野 生 型 秀 丽 隐 杆 线 虫 ( Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ        覃媚等(２０１６) 的方法ꎬ将根系放线菌于改良 ＩＳＰ２
   ｅｌｅｇａｎｓ)均由广西科学院汪斌博士惠赠ꎮ                            固体培养基进行活化培养ꎬ在其对数生长期接种
   １.１.３ 实验试剂  Ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 树脂ꎬ２×Ｅａｓｙ Ｔａｑ Ｓｕ￣          到 ４ 瓶 ２００ ｍＬ 改良 ＩＳＰ２ 液体培养基中ꎬ于 ２８ ℃ 、
   ｐｅｒｍｉｘ 购于 ＢｉｏＲａｄ 公司(美国)ꎻ１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因扩              １８０ ｒｍｉｎ 摇床发酵培养 ７ ｄꎮ 发酵液用等体积
                                                               ￣１
   增 引 物 对 ２７Ｆ ( ５′￣ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ￣            乙酸乙酯萃取三次ꎬ萃取液减压浓缩置于干燥器
   ３′)和 １４９２Ｒ(５′￣ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ￣３′) 购           中低温保存备用ꎮ
   于全式金生物技术有限公司( 中国ꎬ北京)ꎻ５％次                          １.３.２ 红树根系土壤放线菌抗衰老活性测试方法
   氯酸钠购于朗索医用消毒剂有限公司( 中国ꎬ杭                              以秀丽隐杆线虫为模型对红树林根系土壤放线

   州)ꎻ其他试剂均为国产分析纯ꎮ                                   菌发酵产物进行活性筛选ꎬ记录线虫的寿命数据
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