Page 58 - 《广西植物》2020年第3期
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３ ３ ８ 广 西 植 物 ４０ 卷
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倒入无菌平皿中ꎬ待平皿静置冷却 ２ ｈ 后ꎬ待用ꎮ ｍＬ )ꎮ Ｐ３ 和 Ｐ７ 培养基分离效果相近ꎬ获得的细
１.４.２ 初筛 首先将排重后的 ７４ 株细菌ꎬ分别接种 菌均隶属于 １７ 属ꎬ其菌种数和多样性均较高ꎻ而
至 ＩＳＰ２ 固体培养基上ꎬ取生长对数后期的细菌划线 ＡＧＧ 培养基获得的细菌均隶属于 ５ 属ꎬ故其获得
至羊血培养基上ꎬ每板划 ４ 株细菌ꎬ置于 ２８ ℃ 的恒 较少的细菌数和多样性ꎮ
温培养箱培养ꎮ 然后于 ２４ ｈ 后观察平板上微生物 ２.３ 内生及根际细菌的属级水平上的韦恩图分析
的生长情况ꎬ观察是否有透明圈ꎬ颜色变化等ꎮ 再将 在属级水平上对桐花树各组织和其根际来源
产生明显透明圈的菌落划线至 ＩＳＰ２ 固体培养基上ꎬ 细菌进行 ｖｅｎｎ 分析ꎬ结果显示ꎬ从桐花树各组织和
供复筛用ꎮ 根际中获得细菌种类存在较大的差异ꎬ桐花树内
１.４.３ 复筛 参考辛宏等(２０１８) 的方法制备人工 生细菌和根际细菌共有 １０ 个相同的菌属ꎬ分别为
血栓ꎬ取 ３００ μＬ 脱纤维无菌羊血ꎬ至于灭菌西林 Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ.、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ.、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ.、Ｍｉ￣
瓶底部ꎬ加入 ９ μＬ １ ｍｏｌＬ 的 ＣａＣｌ 溶液ꎬ放置 ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ.、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.、Ｍｙｃｏｌｉｃｉ￣
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１０ ｍｉｎꎬ待血液凝固使用ꎮ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.和 Ｍｉｃｒｏｂａｃ￣
将初筛结果良好的 １６ 株细菌ꎬ分别接种于 ５０ ｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.ꎮ 对桐花树各组织与根际来源的细菌分
￣１ 别进行 ｖｅｎｎ 分 析ꎬ仅 有 一 个 共 同 的 芽 孢 杆 菌 属
ｍＬ 改良的 ＩＳＰ２ 液体培养基上ꎬ２８ ℃ ꎬ１８０ ｒｍｉｎ
￣１ (图 ４:Ａ)ꎻ根部分离的细菌与根际细菌有 ８ 个共
摇床培养 ７ ｄꎻ取出发酵液ꎬ８ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １０
ｍｉｎꎬ收集上清液ꎬ用 ０.２２ μｍ 微孔滤膜除菌ꎬ获得 同菌属( 图 ４:Ｂ)ꎬ其他各组织分离的细菌与根际
抗血栓活性待测液ꎻ取 ２ ｍＬ 待测液沿壁缓慢加入 细菌的种属相差较大ꎮ
凝固的人工血栓中ꎬ以 ２ ｍＬ ＩＳＰ２ 液体培养基和 ２ ２.４ 细菌抗血栓活性初筛
ｍＬ ０.７％生理盐水作阴性对照ꎬ以 ２ ｍＬ ０.１７３ ｇ 将初筛的羊血平板放置 ２８ ℃ 培养 ２４ ｈ 后ꎬ观
ｍＬ 血塞通片(含三七总皂苷含量为 １００ ｍｇ) 为阳 察细菌生长和晕圈情况ꎮ 结果显示ꎬ筛选 ７４ 种细
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性对照ꎮ 放入 ２８ ℃ 培养ꎬ每隔 ２４ ｈ 观察一次血凝 菌的抗血栓活性ꎬ有 １８ 种细菌显示出良好的抗血
块溶解情况ꎬ并轻微晃荡ꎬ记录结果ꎮ 栓活 性ꎬ 总 阳 性 为 ２４. ３２％ꎻ 分 别 隶 属 于 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ.、 Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.、 Ｄｅｍｅｑｕｉｎａ ｓｐ.、 Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ
２ 结果与分析 ｓｐ.、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ. 和 Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ.ꎮ 图 ５ 显
示ꎬＢ２０６１、Ｂ２６３５ 和 Ｂ１８２０ 显示无晕圈ꎬ即判定为
２.１ 桐花树中内生及根际细菌多样性分析 无溶血活性ꎻＢ１５０２、Ｂ１５００ 和 Ｂ１８５０ 显示出深色
根据菌落的形态、颜色和大小等特征进行排 晕圈ꎬＢ１９８９、Ｂ２６３４ 和 Ｂ２６３２ 表现为透明圈ꎬ两者
重ꎬ选取 １２５ 株细菌进行测序对比分析ꎬ获得 ７４ 均判定为具有溶血活性ꎮ
种细菌ꎬ其中桐花树各组织中获得 ３４ 种内生细 ２.５ 细菌上清液对体外血栓的影响
菌ꎬ隶属于 １８ 科 ２２ 属ꎻ根际细菌 ４４ 种ꎬ隶属于 ２０ 根据上述抗血栓活性初筛结果ꎬ对 １８ 株有活
科 ２７ 属ꎮ 分别对桐花树的内生细菌和根际细菌 性菌株进行抗血栓活性复筛ꎮ 图 ６ 结果显示ꎬ２４ ｈ
构建 Ｎ￣Ｊ 系统进化树(图 １ 和图 ２)ꎮ 后ꎬＢ１８５０、Ｂ１９８９ 和 Ｂ２６３２ 的上清发酵液将凝血
２.２ 不同培养基对内生和根际细菌的分离效果 块全部溶解ꎮ 其余细菌的上清液与血凝块均有明
采用 ６ 种培养基ꎬ从桐花树中分别获得内生和 显分层ꎬ凝血块较空白对照组的均有变小ꎬ上层溶
根际细菌 ７１ 株和 ６４ 株ꎻ经形态法和 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基 液呈现出红色ꎬ故展示出微弱的溶血活性ꎬＩＳＰ２ 培
因序列对比排重后ꎬ获得 ７４ 株细菌在 ６ 种培养基 养基和生理盐水空白组中凝血块均维持原样ꎬ下
上分离效果( 图 ３)ꎮ 根据其分离效果分析:Ｐ３ 和 层为凝血块ꎬ固液分界线清晰ꎮ
Ｐ７ 培养基分离到细菌种类最多ꎬ均有 １７ 个菌属ꎻ
３ 讨论与结论
ＡＧＧ 培养基分离的细菌种类最少ꎬ包含 ４ 个菌属ꎬ
究其原因可能是 ＡＧＧ 培养基主要成分为淀粉ꎬ较
适合优势放线菌群(链霉菌属)ꎮ 由菌落数统计结 红树植物是生长在热带和亚热带潮间带河口
果可知ꎬＭ１０、Ｍ５、ＡＧＧ、 Ｍ４、Ｐ７ 和 Ｐ３ 培养基上菌 地带的耐盐植物ꎬ分布在 ３０° Ｓ 与 ３０° Ｎ 之间ꎮ 面
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落数分别为 ４. ３、３. １、１. ２、７. ３ 和 ７. ２ ( × １０ ｃｆｕ 对高度盐渍化、土壤缺氧、高光辐射、高矿物组成、
