Page 57 - 《广西植物》2020年第3期

３ 期 李菲等: 桐花树内生和根际细菌多样性及抗血栓活性研究 ３ ３ ７

前处理和分离工作ꎮ 阳性对照药物:血塞通片( 云南维和药业股份
１.１.２ 羊血实验试剂 无菌脱纤维羊血( 初筛羊 有限公司)ꎬ购买于一心药业ꎮ
血)和抗凝羊血(复筛羊血)ꎬ均购买于南宁茂接微 １.１.３ 培 养 基 ( １) 分 离 培 养 基: ＡＧＧ、 Ｍ５、 Ｐ７、
生物科技有限公司ꎮ Ｍ１０、Ｍ４ 和 Ｐ３ꎬ详情信息见表 １ꎮ

表 １ 细菌分离培养基配方
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｎｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
分离培养基 主要成分 其他成分
Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ Ｍａｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
ＡＧＧ 可溶性淀粉 １０.０ ｇꎬ葡萄糖 １.０ ｇꎬ甘油 １０ ｍＬ 琼脂 １４.０ ｇ 复合盐母液 １０ ｍＬ
Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ １０.０ ｇꎬ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ １.０ ｇꎬ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １０ ｍＬ
Ａｇａｒ １４.０ ｇ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｏｎ
Ｍ５ 海藻糖 ５.０ ｇꎬ脯氨酸 １.０ ｇꎬ土壤浸出液 ２０ ｍＬ 去离子水 １ ０００ ｍＬ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ １０ ｍＬ
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ５.０ ｇꎬ ｐｒｏｌｉｎｅ １.０ ｇꎬ ｓｏｉｌ ｅｘｔｒａｃｔ ２０ ｍＬ
Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ－ｗａｔｅｒ １ ０００ ｍＬ
Ｐ７ Ｌ－天门冬酰胺 １.０ ｇꎬ酪氨酸 ０.５ ｇꎬ甘油 １０ ｍＬ ｐＨ ７.２~ ７.４
Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ １.０ ｇꎬ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ０.５ ｇꎬ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １０ ｍＬ
Ｍ１０ 可溶性淀粉 １０.０ ｇꎬ水解酪素 ０.５ ｇ
Ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔａｒｃｈ １０.０ ｇꎬ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｃａｓｅｉｎ ０.５ ｇ
Ｍ４ Ｌ－天门冬酰胺 １.０ ｇꎬ海藻糖 ５.０ ｇꎬ甘油 １０ ｍＬ
Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ １.０ ｇꎬ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ５.０ ｇꎬ ｇｌｙｃｅｒｏｌ １０ ｍＬ
Ｐ３ 粗燕麦粉 ２０.０ ｇ
Ｃｒｕｄｅ ｏａｔ ２０.０ ｇ

注: 复合盐母液 ＫＮＯ ３ １.０ ｇꎬ Ｋ ２ ＨＰＯ ４ ０.５ ｇꎬ ＭｇＳＯ ４ ７Ｈ ２ Ｏ ０.５ ｇꎬ ＮａＣｌ ０.５ ｇꎬ ＮＨ ４ ＮＯ ３ ０.１ ｇꎬ ＦｅＳＯ ４ ０.０１ ｇꎬ ＺｎＳＯ ４ ７Ｈ ２ Ｏ
０.００１ ｇꎬ ＭｎＣｌ ２ Ｈ ２ Ｏ ０.００１ ｇꎬ 去离子水 １０ ｍＬꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＫＮＯ ３ １.０ ｇꎬ Ｋ ２ ＨＰＯ ４ ０.５ ｇꎬ ＭｇＳＯ ４ ７Ｈ ２ Ｏ ０.５ ｇꎬ ＮａＣｌ ０.５ ｇꎬ ＮＨ ４ ＮＯ ３ ０.１ ｇꎬ ＦｅＳＯ ４ ０.０１ ｇꎬ
ＺｎＳＯ ４ ７Ｈ ２ Ｏ ０.００１ ｇꎬ ＭｎＣｌ ２ Ｈ ２ Ｏ ０.００１ ｇꎬ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ￣ｗａｔｅｒ １０ ｍＬ.

(２)纯化培养基(改良 ＩＳＰ２):麦芽提取物 ２.０ 并及时观察菌株的生长情况ꎬ挑取肉眼可见菌落
ｇꎬ葡萄糖 ２.０ ｇꎬ酵母提取物 ２.０ ｇꎬ琼脂 １５.０ ｇꎬ去 进行纯化培养ꎬ记录其形态特征和相同菌落数ꎬ以

离子水 １ ０００ ｍＬꎮ ３０％(Ｖ / Ｖ)甘油￣ＩＳＰ２ 混合液作为保护剂ꎬ将纯化
(３)发酵培养基:改良 ＩＳＰ２ 液体培养基ꎮ 好的菌株制成冻存管保藏于－７０ ℃ ꎮ
１.２ 菌株的分离纯化 １.３ １６Ｓ ｒＲＮＡ 系统发育分析
１.２.１ 样品预处理 参照李菲等(２０１８) 预处理方 采用 Ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 树脂( 周双清等ꎬ２０１０) 快速
法ꎬ代表性地选择桐花树各组织进行细菌的分离 提取细 菌 的 ＤＮＡ 作 为 ＰＣＲ 模 板ꎬ 并 根 据 Ｗａｌｓｈ
实验ꎮ 首先ꎬ用 ５％次氯酸钠溶液浸泡 ３ ~ ５ ｍｉｎꎬ用 (１９９１) 的方法对其进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ 引物为 ２７Ｆ
无菌水冲洗多次ꎻ其次ꎬ用 ０.２％吐温 ２０ 溶液浸泡 和 １５２２Ｒꎬ参照李菲等(２０１８) 的方法设定 ＰＣＲ 反
１０ ｍｉｎꎬ用无菌水冲洗多次ꎻ最后ꎬ用 ７５％的酒精溶 应条件ꎮ 扩增产物经 １％琼脂糖￣ＴＡＥ 凝胶电泳检
液浸泡 ５ ｍｉｎꎬ用无菌水冲洗多次ꎮ 消毒后的组织 测合格后ꎬ委托北京擎科新业生物技术有限公司
样品ꎬ分别用无菌手术刀进行切碎ꎻ取约 １ ｇ 的样 进行测序分析ꎮ 序列经 ＢｉｏＥｄｉｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
品进行充分研磨ꎬ加入 ９ ｍＬ 无菌水与样品混匀ꎬ Ｅｄｉｔｏｒ 软件整理后ꎬ利用 ＥｚＴａｘｏｎ 服务器进行在线
即为初始的组织悬液ꎬ再依次稀释到 １０ 和 １０ 的 比对( Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９)ꎻ以同源性最高菌株的有
￣４
￣３
组织悬液ꎬ待用ꎮ 效序列作为参比对象ꎬ构建 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ 系统
桐花树根际样品的收集ꎬ轻轻刮下根须表面 发育树ꎬ各分支置信值检测设为 Ｂｏｏｓｔｒａｐ１ ０００ 次ꎬ对
附着的土壤ꎬ平铺于无菌平皿中ꎬ经 ６５ ℃ 热风干 各菌株的系统发育地位进行分析(Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ
燥 ３０ ｍｉｎꎮ 称取 ２.０ ｇ 样品装于 ２０ ｍＬ 无菌水中 １.４ 细菌对抗血栓活性的筛选
￣２ ￣３
摇匀ꎻ制成 １０ 和 １０ 稀释度的样液ꎬ待涂布处理ꎮ １.４.１ 羊血培养基制备 以改良 ＩＳＰ２ 固体培养基为
１.２.２ 细菌的分离纯化 取 ２００ μＬ 梯度稀释的样 基础培养基ꎬ１２１ ℃ 高温蒸汽灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ 待培养

液接种于 ６ 种复合营养培养基中ꎬ２８ ℃ 培养数周ꎬ 基冷却至 ５５ ℃ꎬ添加 １０％脱纤维无菌羊血ꎬ摇匀后