Page 65 - 《广西植物》2020年第4期

４ 期 原晓龙等: 蒜头果中 ＣＹＰ７１ 基因克隆与果实不同发育时期的表达分析 ５ ０ ３

ＣＹＰ７１ 基因的报道ꎮ 本研究选择生长 ３ 个月的蒜 －８０ ℃ 冰箱ꎮ
头果果实进行转录组测序ꎬ从转录组数据中搜索 １.４ ＭｏＣＹＰ７１ 的生物信息学分析
获得 ＣＹＰ 基因( 命名 ＭｏＣＹＰ７１)ꎬ采用 ＲＴ￣ＰＣＲ 技 用 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ /
术克隆获得该基因全长 ｃＤＮＡꎬ并用生物信息学分 ｏｒｆｆｉｎｄｅｒ/ )对 ＣＹＰ７１ 基因进行翻译获得其蛋白序
析的方法对其潜在功能进行预测ꎬ再检测该基因 列ꎬ 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔ￣
在果实的不同发育时期的表达量ꎬ为进一步研究 ｐａｒａｍ / )、 ＣＤＤ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ /
蒜头果果实中次生代谢物质的生物合成、揭示对 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ / ｗｒｐｓｂ. ｃｇｉ )、 ＴＭＨＭＭ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.

非生物和病原体胁迫的防御机制奠定基础ꎮ ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ / ) 等 分 析 ＭｏＣＹＰ７１
蛋白的理化性质、保守结构域和跨膜结构域ꎬ并用
１ 材料与方法 ＤＮＡＭＡＮ 比对其氨基酸同源序列ꎬ确定 ＭｏＣＹＰ７１

的保守结构域ꎮ 将蒜头果 ＭｏＣＹＰ７１ 蛋白与 ＮＣＢＩ
１.１ 材料 上已知的其他植物的 ＣＹＰ 蛋白进行多重比对ꎬ并
从生长于云南省文山州广南县旧莫乡岩腊村 用 ＭＥＧＡ７ 软件中邻位相接法(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ) 构
的蒜头果上分别采集花谢后 １ 个月、２ 个月、３ 个 建分子系统进化树ꎮ
月、４ 个月的果实ꎬ同时采集叶片作为对照ꎻ迅速将 １.５ 蒜头果 ＭｏＣＹＰ７１ 基因不同组织表达分析
所采集的样品放入液氮中保存ꎬ带回实验室置于 分别取蒜头果不同组织的 ＲＮＡ ２ μｇꎬ反转录

－８０ ℃ 冰箱中备用ꎮ 合成 ｃＤＮＡ 第一条链ꎮ 以不同组织的 ｃＤＮＡ 为模
１.２ 转录组分析与 ＲＮＡ 提取 板ꎬ用特异引物 ＴＭｏＣＹＰ７１Ｆ(５′￣ＡＣＣＧＣＣＧＴＣＧＣ￣
将花谢后 ３ 个月的蒜头果果实送到华大基因 ＣＣＡＡＴＣＴＴＣ￣３′) 和 ＴＭｏＣＹＰ７１Ｒ ( ５′￣ＡＡＣＡＧＡＧ￣
进行转录组测序ꎬ通过对转录组 Ｕｎｉｇｅｎｅ 进行本地 ＣＡＴＧＡＧＧＡＣＴＴＧＧ￣３′)进行荧光定量 ＰＣＲ 分析ꎬ
Ｂｌａｓｔꎬ 并 将 各 Ｕｎｉｇｅｎｅ 在 ＮＲ、 ＮＴ、 Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ、 并以 ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １￣ａｌｐｈａ 基因作为内参基因ꎮ
ＫＥＧＧ、ＣＯＧ、ＧＯ 等数据库中进行注释和分析ꎬ寻 具体 反 应 体 系 如 下: 分 别 向 ＰＣＲ 管 中 加 入 ２ ×
找蒜 头 果 果 实 转 录 组 中 的 ＣＹＰ７１ 基 因ꎮ 按 照 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ( 含 ＲＯＸ) １２.５ μＬ、 引物
Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡ 提取试剂盒说明书的步骤提取 ＴＭｏＣＹＰ７１Ｆ 和 ＴＭｏＣＹＰ７１Ｒ 各 ０. ５ μＬ、 ｃＤＮＡ １
蒜头果果实和叶片的总 ＲＮＡꎬ用 １％的琼脂胶检测 μＬꎬ最终用 ＰＣＲ ｗａｔｅｒ ｎｕｃｌｅ￣ｆｒｅｅ 补足 ２５ μＬꎮ ＰＣＲ
所有样品 ＲＮＡ 的完整性ꎮ 再取 １ μｇ 符合试验要 反应条件:首先ꎬ预变性温度 ９５ ℃ ꎬ时间 １０ ｍｉｎꎻ

求的 ＲＮＡ 进行反转录得到 ｃＤＮＡꎬ将 ｃＤＮＡ 保存在 然后ꎬ变性温度 ９５ ℃ ꎬ时间 １５ ｓꎻ最后ꎬ退火和延伸
－２０ ℃ 冰箱中备用ꎮ 温度为 ６０ ℃ ꎬ时间为 ３０ ｓꎬ共 ４０ 个循环ꎮ 反应结
１.３ 蒜头果 ＭｏＣＹＰ７１ 基因克隆 束后ꎬ收集信息做 Ｃｔ 值分析ꎮ
通过对蒜头果转录组数据分析ꎬ获得表达量
高且拥有完整开放阅读框的 ＣＹＰ 基因ꎬ以获得的 ２ 结果与分析
ＣＹＰ 基因序列ꎬ设计含有起始密码子的特异引物

( ＭｏＣＹＰ７１Ｆ: ５′￣ＡＴＧＣＡＣＴＴＧＡＧＣＴＴＣＣＡＡＡＧ￣３′) ２.１ 蒜头果 ＭｏＣＹＰ７１ 基因的克隆
和含有终止密码子的特异引物( ＭｏＣＹＰ７１Ｒ: ５′￣ 通过对蒜头果转录组数据的分析ꎬ获得一条
ＧＧＴＡＴＡＡＴＴＧＧＧＡＴＧＣＡＴＡＧ￣３′)ꎮ 以蒜头果果实 植物细胞色素 Ｐ４５０ 相关的 ＤＮＡ 序列ꎬ并以其为
ｃＤＮＡ 为模板ꎬ用 ＨｉＦｉ 高保真聚合酶进行 ＰＣＲ 扩 基础设计特异引物 ＭｏＣＹＰ７１Ｆ 和 ＭｏＣＹＰ７１Ｒꎬ以
增ꎬ电泳检测后通过将目的片段连接到 ｐＧＭＴ 载体 蒜头果果实的 ｃＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ获得
上、转化、菌落 ＰＣＲ 筛选获得含 ＭｏＣＹＰ７１ 基因的 一条长 １ ５７２ ｂｐ 的 ｃＤＮＡ 序列(图 １)ꎬ将其命名为
阳性克隆ꎬ送上海生工测序ꎬ最终通过序列比对确 ＭｏＣＹＰ７１ 基 因 ( ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号 为 ＭＫ１７２８５８)ꎮ
定获得 ＭｏＣＹＰ７１ 基因全长 ｃＤＮＡꎬ并永久保存在 将 ＭｏＣＹＰ７１ 基 因 的 ｃＤＮＡ 序 列 在 ＮＣＢＩ 上 进 行