Page 87 - 《广西植物》2020年第8期
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１ １ ４ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷
温响应机制和代谢水平的差异ꎬ以及通过响应冷 物主要的低温差异表达基因序列ꎬ设计实时荧光
胁迫的关键节点基因的序列差异ꎬ来探索不同低 定量检测引物( 各基因的引物序列与内参基因引
温耐受性植物间线粒体的低温表达模式的差别ꎬ 物表 １)ꎬ进行 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 实验ꎮ 分析三种植物的线
为进一步研究植物线粒体冷胁迫响应机制和相关 粒体基因低温差异表达情况ꎬ是否与转录组中筛
基因功能奠定理论基础ꎮ 选的低温差异表达趋势一致ꎮ
１.４ 三种植物的线粒体呼吸链基因的启动子分析
１ 材料与方法 从筛选出的低温差异表达基因中ꎬ找到与呼
吸链组成密切相关的基因ꎬ并获得其启动子序列
１.１ 雪莲、番茄、拟南芥线粒体低温差异表达基因 (雪莲基因组由祝建波研究员提供ꎬ未发表)ꎬ使用
的抽取 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ (Ｌｅｓｃｏｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２) 在线网站分析其
雪莲转录本源数据( 李锦等ꎬ ２０１７) 的下载ꎬ 顺式作用原件ꎬ统计并分析呼吸链相关基因启动
以向日葵、菊花等菊科线粒体基因参照ꎬ与转录本 子中的顺式作用元件功能与数量ꎮ 对含有低温响
进行比对ꎬ参照雪莲转录组注释文件ꎬ筛选出雪莲 应元件的线粒体基因表达差异进行分析ꎮ
线粒体基因的低温差异表达量数据ꎬ编写 ｐｙｔｈｏｎ １.５ 多种植物线粒体低温差异表达基因的进化关
脚本并筛选其基因序列ꎮ 番茄低温转录本数据 系分析
(Ｂａｒｒｅｒｏ￣Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６) 的下载ꎬ以 ＮＣＢＩ 数据库 下载了 １７ 种拥有不同低温耐受性植物线粒体基
中的番茄线粒体基因组为参考ꎬ从源数据中筛选 因组序列ꎬ抗寒植物包括尖叶牛舌藓(Ａｎｏｍｏｄｏｎ ａｔ￣
出其线粒体基因的低温表达量数据ꎮ 拟南芥低温 ｔｅｎｕａｔｅｓ)、万年藓(Ｃｌｉｍａｃｉｕｍ ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ)、欧洲山杨
转录组源数据(Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５) 下载ꎬ以拟南芥 (Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌａ)、人参(Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ)ꎬ耐寒植物有
线粒体基因组( Ｓｌｏａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８) 为参考ꎬ筛选出 柴胡(Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ ｆａｌｃａｔｕｍ)、蚕豆(Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ)、沙冬青
拟南芥线粒体的低温差异表达量数据ꎮ (Ａｍｍｏｐｉｐｔａｎｔｈｕｓ ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ)ꎬ 较 耐 寒 植 物 有 甘 蓝
１.２ 三种植物线粒体基因低温差异表达对比 (Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ)、菊花(Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｂｏｒｅａｌｅ)、向
根据三种植物的低温差异表达的线粒体基因 日葵 ( Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ)ꎬ 以 及 不 耐 寒 的 天 仙 子
表达量数据ꎬ使用 Ｒ 语言中的 ｐｈｅａｔｍａｐ 包进行聚 (Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ ｎｉｇｅｒ)、烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔｅ)、丹参
类分析ꎬ比较其低温线粒体基因表达差异ꎬ并分析 (Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ)、巨桉(Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ)、辣椒
差异表达基因分属的不同代谢通路ꎬ分析其代谢 (Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ)、葡萄藻(Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ)、共
通路差异与低温胁迫之间的关系ꎬ主要从代谢通 球藻(Ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ ｓｐ.)ꎮ 通过对不同适应温度的
路的关键节点基因入手ꎮ 植物线粒体基因蛋白保守序列的比对与进化关系分
１.３ 三种植物线粒体低温差异表达基因的验证 析ꎬ来探索和讨论不同植物间在低温胁迫下的线粒体
对以上筛选的部分线粒体低温差异表达基因 基因的作用与响应机制ꎮ 首先使用 ＤＮＡＭＡＮ 对线粒
进行实时荧光定量实验验证ꎬ检测其转录组数据 体基因中响应低温的蛋白序列进行多序列比对ꎬ并使
的准确性ꎮ 根据三种植物低温转录本的测定条 用 ｍｅｇａ７ 分析它们之间的进化关系与距离ꎮ 主要探
件ꎬ分别对其进行低温处理ꎬ雪莲组培苗低温处理 究其低温耐受性与线粒体差异表达基因序列相似性
组为 ４ ℃ 冷驯化 ７ ｄꎬ－２ ℃ 再处理 ４８ ｈꎬ参照组为 的关系ꎮ
４ ℃ 冷驯化 ７ ｄꎬ所用雪莲为生长 ２ 个月的组培苗ꎻ
拟南芥低温处理组条件为 ４ ℃ 处理 ２４ ｈꎬ参照组 ２ 结果与分析
条件为 １８ ℃ 培养基中正常生长 ２ 周的拟南芥ꎻ番
茄低温处理组条件为 １０ ℃ 处理 ４８ ｈꎬ参照组条件 ２.１ 三种植物低温差异表达线粒体基因筛选
为 ２５ ℃ 正常生长 ３ 周的番茄栽培苗ꎮ 分别提取 从三种植物的转录本中共筛选出 ３２ 个线粒体
其 ＲＮＡ 并反转录为 ｃＤＮＡꎬ根据筛选出的三种植 差异表达基因ꎬ 雪莲 ２ 个ꎬ 番茄 １５ 个ꎬ 拟南芥 ２４
