Page 94 - 《广西植物》2021年第4期
P. 94
ጢ Ꭾ ᤃ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ϟ 卷
表 ϓই 实时荧光定量 ۗࣷቴ 检测引物
ఋᑕᤦᔀ ϟজ ۪ʢᔽቝᔀʢ ᔽႿᆍʢቝᑕᡷᔽᆍႿ ᆍ ीఋ᥋۪ऊ
基因名称 上游引物 ྉጢࣕ᥋ሕࣕɯ 下游引物 ྉጢࣕ᥋ሕࣕɯ
᥈ᔀႿᔀ Ⴟᑕቝᔀ èᆍʢऔᑕʢʛ ᡱʢᔽቝᔀʢ ᔀᔀʢ༁ᔀ ᡱʢᔽቝᔀʢ
ዛ၊ଧዛᣞϟ ఋዶ᥈ఋఋऊऊ᥈ऊዶዶऊఋఋ᥈᥈ఋऊዶ᥈ ዶዶ᥈᥈ఋఋ᥈ऊఋऊዶዶఋ᥈ዶ᥈ఋऊऊ᥈
Іଧͅϟԡቴ ऊ᥈ऊዶऊዶऊఋऊ᥈ऊఋ᥈ዶऊఋዶऊዶዶऊ ऊዶऊ᥈᥈ዶ᥈ዶऊ᥈᥈ዶ᥈᥈ዶऊዶዶ᥈᥈
ϟᤃ 目的蛋白的表达和纯化 量 ۪ऊ 技术ᖔ 我们对 ዛ၊ଧዛᣞϟ 分别在花生品种
ϟᤃϟ 诱导表达জ 将含有 ᡱ᥈ጶᣮ᥋ᤃᡱ᥋ϟ᥋ዛ၊ଧዛᣞϟ᥋ऊ᧕ ጸԻ̀ᆥྉ铝敏感型ɯ和ጸँँͱϟጢԡᎮᆥྉ 铝耐受型ɯ 中铝
质粒的冻存 ᆍ༁ᔀᡷᡷᑕྉ᧕ጶሕɯ菌株进行活化ᖔ挑选单克 处理下的表达模式进行了分析ᤥ 如图 ϟ 所示ᖔ在
᥋ϟ ᥋ϟ
隆于 ጢቝᓂ 含抗生素ྉ ዶቝᡱ ϟԡԡ ဂ੫ኼቝᓂ ᖔऊၤ ϟԡԡ ϟԡԡ ဂቝቝᆍ ኼ ᓂ 铝胁迫条件下ᖔ 两品种根尖
ဂ੫ኼቝᓂ ɯᓂା 液体中ଫ待菌液浑浊后ᖔ按照 ྉ 菌 ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因的表达模式不同ᤥ 铝处 理 ࿗ၤ 时ᖔ
᥋ϟ
液ɯᨒ ྉᓂା 液体ɯ ᢉ ϟ ᨒ ϟԡԡ 的比例加入至 ԡԡ ቝᓂ ጸԻ̀ᆥ根尖 ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因的表达与对照有显著差
᥋ϟ ᥋ϟ 异ᖔ明显升高ଫ随着铝处理时间的延长ᖔዛ၊ଧዛᣞϟ 基
ᓂା 液体ྉዶቝᡱ ϟԡԡ ဂ੫ኼቝᓂ ᖔऊၤ ϟԡԡ ဂ੫ኼቝᓂ ɯ中ᖔ
᥋ϟ 因表达量会降低ᖔ但仍高于对照ଫ铝处理 ࿗ ၤ 后表
ሕᎮ ቩᖔԡ ʢኼቝᔽႿ 培养 ሕጲ࿗ ၤᖔ待 ᨃ᧕ ᢉ ԡጢ ጲ ԡऐᖔ
ᤃԡԡ
᥋ϟ
取 ቝᓂ 菌液作为未诱导样品ᖔ于 ऐ ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ 在 ࿗ 达量又有所上升ᤥ 铝处理 ࿗ܦऐܦϟ ၤ 均显著提高了
ቩ离心 ϟԡ ቝᔽႿ 保存沉淀待检测ᤥ 其余菌液加入 ጸँँͱϟጢԡᎮᆥ根尖 ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因的表达水平ᖔ但随后
᥋ϟ
᧧۪ఋ᥈ 使其终浓度为 ԡϟ ቝቝᆍኼᓂ ᖔ于 ϟᤃ ቩᖔϟԡԡ ʢኼ 基因表达下降ᖔ至铝胁迫处理 ࿗ ၤ 时表达量会降
ቝᔽႿ 条件下培养 ϟጢጲϟᤃ ၤᖔ取 ቝᓂ 菌液作为诱导后 低ᖔ但仍高于对照ᤥ
᥋ϟ
总蛋白对照离心待检测ᤥ 剩余的菌液于ऐԡԡԡ ʢኼ
᥋ϟ
ቝᔽႿ 在 ࿗ቩ离心 ϟԡ ቝᔽႿᖔ去上清液ᖔ按 ྉ菌液ɯᨒ
ྉϟԡ ቝቝᆍኼᓂ ۪ା୩ɯᢉ ϟԡ ᨒ ϟ 加入 ۪ା୩ 溶解沉淀ᖔ液
᥋ϟ
氮速冻后加入 ۪ᥘ୩è 使其终浓度为 ϟቝቝᆍኼᓂ ᖔ重
᥋ϟ
悬菌液进行超声破碎 ϟԡ ቝᔽႿྉ超声 ጢ༁ᖔ停 ጢ༁ᖔ功率
᥋ϟ
ሕԡᠮɯᖔ破碎结束后 ऐ ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ ᖔ࿗ ቩ离心 ϟԡ ቝᔽႿᖔ
分离上清和沉淀ᖔ沉淀用 ϟԡ ቝቝᆍኼᓂ ۪ା୩ྉ过滤除
᥋ϟ
菌ɯ重悬ᖔ取未诱导和诱导后总蛋白的沉淀重悬液ᖔ
与超声后上清ܦ沉淀重悬液各 ጢ ဂᓂᖔ分别加入 Ꭾጢ
ဂᓂ ࿗ ġᆍᑕʛᔽႿ੫ ᤦࣼᔀʢᖔ涡旋混匀ᖔ于 ϟԡԡ ቩᖔ变性 ϟԡ
᥍表示各处理间在 ԡԡጢ 水平上具有显著差异ᤥ
ቝᔽႿᖔ取变性后蛋白进行 ϟᠮ ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 电泳ᖔ分析 ᥍ ᔽႿʛᔽዹᑕᡷᔀ༁ ᡷၤᑕᡷ ᡷၤᔀʢᔀ औᔀʢᔀ ༁ᔽ੫ႿᔽᔽዹᑕႿᡷ ʛᔽᔀʢᔀႿዹᔀ༁ ᑕᡷ ԡԡጢ ᔀᔀ
ᑕቝᆍႿ੫ ʛᔽᔀʢᔀႿᡷ ᡷʢᔀᑕᡷቝᔀႿᡷ༁
蛋白是否被诱导表达ᤥ
图 ϟজ 不同 ዶ 处理时间下花生根 ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因的表达
ϟᤃ 蛋白纯化জ 参考 ᥈ጶ 公司 ᥈ࣼᡷᑕᡷၤᔽᆍႿᔀ ୩ᔀᡱၤᑕʢᆍ༁ᔀ
èᔽ੫ ϟজ ጶᡱʢᔀ༁༁ᔽᆍႿ ᆍ ዛ၊ଧዛᣞϟ ੫ᔀႿᔀ ᔽႿ ᡱᔀᑕႿࣼᡷ ʢᆍᆍᡷ༁
࿗ା 填料说明手册将诱导超声后的蛋白上清液进行
ࣼႿʛᔀʢ ʛᔽᔀʢᔀႿᡷ ᑕࣼቝᔽႿࣼቝ ᡷʢᔀᑕᡷቝᔀႿᡷ༁
纯化ᖔ并用 ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 电泳分析蛋白纯化效果ᤥ
ԣॹԣ ዛ၊ଧዛᣞϓ 基因克隆
জ 结果与分析 首先ᖔ将扩增产物与 ᡱᥘ᧕ϟँ᥋ఋ 连接并转化至
᧕̀ጢም 感受态细胞ᖔ然后进行 ۪ऊ 验证ᖔ结果见图
ԣॹϓ ዛ၊ଧዛᣞϓ 基因在不同铝处理时间表达分析 ᤥ 从图 可以看出ᖔ在约 ԡԡԡ ᤦᡱ 处出现特异性
在对铝处理下花生根尖 转录组数据的分析 条带ᖔ与目的基因大小相符ᖔ将含目的片段的阳性
中ᖔ我们发现了一个预测编码 ାዶϟ 蛋白的基因 菌株进行测序验证ᖔ结果表明扩增的 ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因
ྉዛ၊ଧዛᣞϟɯ受铝胁迫诱导上调ᤥ 基于实时荧光定 序列 与蔓花生 ྉ ዛʗᐹዞ၊ᔠ ʐࣩʗᐹႥᓣႥᔠɯ 的同源性高
