Page 95 - 《广西植物》2021年第4期
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࿗ 期 韦莉等᧥ 花生类受体蛋白激酶基因 ዛ၊ଧዛᣞϟ 的克隆及原核表达 ጢ Ꭾ Ꭾ
达 ϟԡԡᠮᤥ 蛋白序列中不存在信号肽ᖔ且通过 ۪୩ᨃఋ ᧧᧧ 预测
ዶၤାዶϟ 可能的定位ᖔ发现 ዛ၊ଧዛᣞϟ 定位于细胞质
膜的可能性最高ᖔ为 Ꭾϟᠮᖔ说明其编码的蛋白质很
有可能定位在细胞质膜上发挥作用ྉ图 ᤃɯᤥ
ሕ࿗ ዶၤାዶϟ 氨基酸序列比对与进化树构建জ 通
过 શऊା᧧᥋ାᓂዶ୩ఋ 分析获得部分物种与 ዶၤାዶϟ 比
较的氨基酸序列ᖔ并通过 ᥘጶ᥈ዶጢ ԡ 构建进化树
图 জ 菌液 ۪ऊ 检测电泳图
ྉ图 Ꭾɯ分析可知 ዶၤାዶϟ 与大豆ྉ ᤩᤀᡥዞᔠႥᓣ ቂᐹଝɯ 和
èᔽ੫ জ ᧕ᔀᡷᔀዹᡷᔽᆍႿ ᆍ ʢᔀዹᆍቝᤦᔽႿᑕႿᡷ ᡱᑕ༁ቝᔽʛ ᡱᥘ᧕ϟँ᥋ఋ᥋ዛ၊ଧዛᣞϟ
木豆ྉࣷᐹᢝᐹႥࣩ ዞᐹᢝᐹႥɯ等豆类的亲缘关系较近ᖔ而与
拟南芥及野大豆ྉ ᤩᤀᡥዞᔠႥᓣ ᅳᢝᐹɯ 的亲缘关系较远ᤥ
将克隆得到的核酸序列翻译得到氨基酸序列ᖔ
通过 ᧕શዶᥘዶશ 序列比对分析可知多个富亮氨酸
与部分已报道物种的 ାዶϟ 氨基酸序列进行比对ᤥ
重复区域序列以及激酶域序列在各物种中相对保
结果发现ᖔ比对物种的 ାዶϟ 序列在 ሕ࿗ ጲ ᤃϟሕ ᑕᑕ
守ᖔ不保守区域主要集中在序列的 શ 端区域ᖔ可能
ྉ୩ఋᡸାዶϟ 结构域ɯ之间保持高度一致ᖔ且在 ᓂ
与部分差异功能执行有关ᤥ
区ྉᤃ࿗ጲሕԡ ᑕᑕɯ也较一致ᖔ鉴于克隆得到的 ዛ၊ଧዛᣞϟ
ሕጢ ዶၤାዶϟ 蛋白结构和结构域分析预测জ 用
序列含有 ୩ఋᡸାዶϟᡸ结构域保守的活性位点和富
୩ᨃ۪ᥘዶ 在线预测 ዶၤାዶϟ 蛋白二级结构ᖔ结果表
亮氨酸区域ᖔ故属于花生 ାዶϟ 家族ྉ图 ሕɯᤥ
明 ዶၤାዶϟ 蛋 白 质 二 级结构主要由 ም 螺旋
ԣॹᇺ ዛ၊ଧዛᣞϓ 基因的生物信息学分析
ྉ࿗ϟᤃԡᠮɯܦ 无规则卷曲 ྉ࿗ԡ ᤃ࿗ᠮɯ 和延伸链
ሕϟ ዶၤାዶϟ 蛋白理化性质分析জ ዛ၊ଧዛᣞϟ 基因序
ྉϟሕᎮᤃᠮɯ 组成ᖔ且在 શऊା᧧ 网站工具中分析氨基
列完整开放阅读框大小为 ϟ ऐᎮऐ ᤦᡱᖔ编码 ᤃጢ 个氨
酸序 列 发 现 ዶၤାዶϟ 蛋 白 含 有 蛋白激酶家族
基酸ᤥጶ۪ዶ୩ᢃ 在线预测 ዶၤାዶϟ 蛋白分子量大小
۪ዹ᥋ᔽҴᔀ 保守结构域以及富亮氨酸激酶保守结构
为 ᤃँ ϟԡ Ҵ᧕ᖔ 等电点为 ጢ ँϟᖔ 化学分子式为
域 ۪ᓂશԡԡϟϟሕ 或 ۪ᓂશԡԡϟϟྉ图 ऐɯᤥ
ऊ ̀ શ ᨃ ୩ ᖔ正电荷残基数为 ᤃ࿗ᖔ负电荷残
ሕԡጢጢ ࿗ऐᤃԡ ऐ࿗ ँϟऐ ሕ 预测获得的 ዶၤାዶϟ 蛋白三级结构ྉ 图 ँɯ 与
基数为 Ꭾᖔ亮氨酸含量最高ྉ占比 ϟሕϟᠮɯᖔ色氨酸
二级结构结果相符合ᖔ主要是由 ም 螺旋ܦ无规则卷
含量最低ྉ占比 ϟሕᠮɯᖔ不稳定系数为 ሕᎮϟϟᠮᖔ指数
曲和延伸链进一步折叠组装形成三级结构ᖔ且与
较低为稳定蛋白ᖔ半衰期为 ሕԡ ၤᖔ预测得到蛋白质的
拟南芥 ାዶϟ 预测得到的其中一个三级结构符合ᖔ
平均亲水系数是 ͱԡϟँᖔ故此蛋白为疏水蛋白ᤥ
进一步证明 ዶၤାዶϟ 属 ାዶϟ 家族ᤥ
ሕ ዶၤାዶϟ 跨 膜 结 构与疏水性预测 জ ԣॹ ዛ၊ଧዛᣞϓ 基因原核表达载体构建
ఋᥘ̀ᥘᥘԡ 可在线预测蛋白是否存在跨膜结构ᖔ 为了 获 得 可 溶性重组蛋白ᖔ 本研究基于
结果见图 ࿗ᤥ 从图 ࿗ 可以看出ᖔዶၤାዶϟ 为跨膜蛋 ఋᥘ̀ᥘᥘԡ 预测蛋白跨膜域以及 ዶၤାዶϟ 蛋白激
白ᖔ跨膜区域氨基酸起始于 ϟሕ ᑕᑕᖔ终止于 ሕԡ ᑕᑕᖔ但 酶域预测的基础ྉ 图 ϟԡɯᖔ尽可能规避了跨膜区域
据预测 结 果 分 析 可知其可能是双跨膜蛋白ᖔ 在 的疏水氨基酸残基ᖔ选择预测的胞内域中包括完
ԡԡ ጲ ሕԡԡ ᑕᑕ 之间也可能存在跨膜区域ᤥ 整 ାዶϟ 激酶域的 ᎮऐᎮ ጲ ϟ ऐᎮጢ ᤦᡱ 做后续原核表达
利用 ۪ʢᆍᡷ୩ዹᑕᔀ 在线软件预测 ዶၤାዶϟ 蛋白的 研究ᤥ 采用同源克隆的方法ᖔ获得阳性菌株ྉ图 ϟϟɯ
疏水性ᖔ结果分析表明在氨基酸序列的各位点预 并 进行测序ᤥ 经测序比对ᖔ 获得 ᡱ᥈ጶᣮ᥋ᤃᡱ᥋ϟ᥋
测分值均为正值ᖔ平均值大于 ԡᖔ表明 ዶၤାዶϟ 为 ዛ၊ଧዛᣞϟऊ᧕ 重组表达质粒ᤥ
疏水蛋白ྉ图 ጢɯᤥ ԣॹጇ 重组蛋白的诱导与纯化
ሕሕ ዶၤାዶϟ 蛋白信号肽与亚细胞定位分析জ 信 ጢϟ 重组蛋白的诱导জ 诱导表达后取变性蛋白
号肽是蛋白质 શ 端一段特异的氨基酸序列ᖔ辅助 ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 检测ᖔ结果如图 ϟᤥ 从图 ϟ 可知ᖔ在 ࿗
蛋白完成信号转导ᤥ ୩ᔽ੫Ⴟᑕ࿗ϟ 预测表明 ዶၤାዶϟ 个不同 ᧧۪ఋ᥈ 浓度诱导下ᖔ 在 Ꭾԡ ጲ ϟԡԡ Ҵ᧕ 之间均
