Page 155 - 《广西植物》2022年第8期

ϟ ࿗ ԡ ࿗ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗԰ 卷
芽孕育的关系也尚未明确ᤥ ఋᑕҴᑕʢᑕ 公司ᖔ核酸染料 ᥈ᔀ᤟ ୩ᡷᑕᔽႿܦጶᑕ༁ᢃ ۪ࣼʢᔀ ͐ࣼᔽዹҴ
高等植物的生长发育过程受基因的表达量控 ᥈ᔀ᤟ ጶ଴ᡷʢᑕዹᡷᔽᆍႿ ᣽ᔽᡷ 凝胶回收试剂盒和 ା᤟ࣼႿᡷ 载体均
制ᖔ基因的转录水平受包含顺式作用元件的启动 购自北京全式金生物技术有限公司ᖔऊ᤟ᆍႿጶ଴ᡱʢᔀ༁༁ ᗀ
子影响ྉ᧕ᔀᢃ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ԰ԡϟጢɯᤥ 拟南芥 ዛᡙዛᦵቴ 和 ዛᡙዛᧇÞ В᤟ᡷʢᑕ ᨃႿᔀ ୩ᡷᔀᡱ ऊ᤟ᆍႿᔽႿ੫ ᣽ᔽᡷ 重组酶购自诺唯赞生物
启动子可调控花和花药的发育 ྉ ୩ၤᔽၤ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ԰ԡϟ࿗ଫ 公司ᖔ 大肠杆菌 ྉ ጛ໧ዞ၊ᓣʗᔠዞ၊ᔠᐹ ዞᅳᤀᔠɯఋϟ 与农杆菌
᧕ᑕᔽᔀᡷᑕ᤟঎ᖔ԰ԡϟँɯᖔ表明启动子在影响植物的性状和 ྉዛ੖ʗᅳᤇᐹዞᡙᓣʗᔠࣩቂɯ ᥈჆ሕϟԡϟ 购自上海唯地生物公司ᖔ
调控方式上发挥重要作用ᤥ 本研究采用 ኏ዶऊጶ 克 过表达载体 ۪ା᧧ϟ԰ϟ᥋᥈В୩ 由本实验室提供ᖔ引物合
隆技 术获得北美鹅掌楸 ᒦᡙዛᤩ᧣ϟ 基因的全 长 成由南京金斯瑞公司完成ᖔ其编号及序列见表 ϟᤥ
ዹ᧕શዶᖔ并对其进行生物信息学预测及组织差异表 ϓॹԣ 方法
达分析ᖔ初步了解该基因功能ᖔ并重点关注 ᒦᡙዛᤩ᧣ϟ ϟ঎԰঎ ϟ 目的基因的克隆 জ 根据北美鹅掌楸 ྉ ᒦॹ
基因启动子序列的分析和组织表达特异性ᖔ旨在 ᡙࣩᤀᔠᡓᔠஏᓣʗᐹɯ转录组数据库ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ ᣰ ᣰ ᑕႿዹᑕႿ੫ᔽᆍ঎ࣼ੫ᑕ঎ᔀʛࣼ ᣰ
为 ᒦᡙዛᤩ᧣ϟ 基因启动子对相关基因的调控机制研 ዹᆍႿᡷᔀႿᡷᣰ ᤟ᔽʢᔽᆍʛᔀႿʛʢᆍႿ᥋ᡷࣼ᤟ᔽᡱᔽ஦ᔀʢᑕɯᖔ 筛选出注释名 为
究奠定基础ᤥ ዛᤩ᧣ϟ 基因的 ጶ୩ఋ 序列ᖔ 通过 ᨃ᤟ᔽ੫ᆍ Ꭾ 软件设计
۪ऊ኏ 扩增 引 物ᖔ以 北 美鹅掌楸叶芽的 ዹ᧕શዶܦሕࣕ᥋
ϟজ 材料与方法 ኏ዶऊጶ 和 ጢࣕ᥋኏ዶऊጶ 为模板ᖔ扩增 ᒦᡙዛᤩ᧣ϟ 基因的 ሕ

个目的片段ᤥ۪ऊ኏ 体系为 ጢԡ ဂᓂᖔ扩增程序᧥ँऐ ቩ
ϓॹϓ 材料 ሕቝᔽႿଫँऐቩ ϟԡ ༁ᖔጢऐ ቩ ሕԡ༁ᖔᎮ԰ቩ ϟቝᔽႿᖔ共 ሕጢ 个
ϟ঎ϟ঎ϟ 不同组织的取样জ 在南京林业大学的鹅掌 循环ଫᎮ԰ ቩ 彻底延伸 ጢቝᔽႿᤥ 将目的片段连接至
楸种源试验林中ᖔ选取物候期基本一致的北美鹅 ା᤟ࣼႿᡷ 载体后转化大肠杆菌 ఋϟ 感受态细胞ᖔ挑菌送
掌楸ྉ美国南卡罗来纳州种源ɯ 和鹅掌楸ྉ 中国武 测ᤥ 利用 ᧕શዶᥘዶશ 软件拼接后获得全长 ዹ᧕શዶ 序
夷山种源ɯ作为供试材料ᤥ ԰ԡϟऐ 年 ࿗ 月ᖔ分别采集 列ᖔ使用 શऊା᧧ ᨃ኏è èᔽႿʛᔀʢ 在线软件 ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ

长势良好的 ሕ 个株系幼嫩叶片的 ሕ 个部位ྉ 叶缘ܦ औऔऔ঎Ⴟዹᤦᔽ঎Ⴟ᤟ቝ঎ Ⴟᔽၤ঎ ੫ᆍ׹ ᣰ ᆍʢ஦஦ᔽႿʛᔀʢ ᣰ ɯ 预测开放阅读框
叶基部和叶中部ɯᖔ具体参考沈宗根等ྉ԰ԡԡሕɯ 的方 并设计引物ᖔ验证基因克隆的正确性ᤥ 依据验证
法ᤥ 同时ᖔ采集北美鹅掌楸同一时期的 ऐ 个组织 成功的 ዛᤩ᧣ϟ 基因 ऊ᧕୩ 序列ᖔ查找其上游启动子
样品ྉ叶片ܦ茎ܦ雄蕊ܦ雌蕊ܦ花芽ܦ花萼ܦ叶芽和花 序列ᤥ 该启动子序列信息来自鹅掌楸ྉ庐山种源ɯ
瓣ɯᤥ ԰ԡϟऐ 年 ሕᗵऐ 月期间ᖔ分别采集北美鹅掌楸 શȮèВ᥋ᓂዹၤᔽ᥋԰঎ ԡ 基因组测序结 果 ྉऊၤᔀႿ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ
叶芽萌动期ܦ幼叶期ܦ叶成熟期和叶衰老期的叶 ԰ԡϟँɯᖔ利用同源克隆法设计验证引物ᖔ引物序列
片ᖔ具体参考肖怀娟ྉ԰ԡϟ࿗ɯ 的方法ᤥ 可将其划分 见表 ϟᤥ 使用改良 ऊఋዶା 法ྉ马明等ᖔ԰ԡԡᎮɯ提取采
为 Ꭾ 个部分ᖔ即 ᑕܦዹ 和 ᔀ 为叶缘凸出部分ᖔᤦ 和 ʛ 样组织的 ᧕શዶᖔ以此为模板扩增出约 ԰ ԡԡԡ ᤦᡱ 的
为叶缘凹陷部分ᖔ஦ 为叶柄ᖔ੫ 为叶中间部分ᤥ 据前 启动子序列并测序确认ᤥ
期的物候观察发现ᖔ在 Ꭾ 月ᖔ北美鹅掌楸叶片的形 ϟ঎԰঎԰ ᒦᡙዛᤩ᧣ϟ 基因的生物信息学分析জ 使用 શऊା᧧
态变异最大ᤥ 因此ᖔ本研究于 ԰ԡϟऐ 年 Ꭾ 月采集北 ዹᆍႿ༁ᔀʢ׹ᔀʛ ʛᆍቝᑕᔽႿ 在线软 件 ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ औऔऔ঎ Ⴟዹᤦᔽ঎
美鹅掌楸不同大小的叶片ᖔ用消毒的剪刀分离样 Ⴟ᤟ቝ঎ Ⴟᔽၤ঎ ੫ᆍ׹ ᣰ ዹʛʛɯ 预测 ᓂᡷዶ᥈ᨃϟ 蛋白的保守结构
品至 ϟ੫ᖔ具体参考李四游ྉ԰ԡϟጢɯ 的方法ᤥ 所有样 域ᤥ 使用 ጶ଴۪ዶ୩ᢃ 中的 ۪ʢᆍᡷᡱᑕʢᑕቝ 工具 ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ
品重复取样 ሕ 次ᖔ置于ͱऐԡ ቩ 超低温冰箱中保存ᖔ औᔀᤦ঎ᔀ଴ᡱᑕ༁ᢃ঎ ᆍʢ੫ ᣰ ᡱʢᆍᡷᡱᑕʢᑕቝ ᣰ ɯ 在线分析蛋白质理化
用于提取 ኏શዶᤥ 性质ᖔ 使用 ୩ᨃ۪ᥘዶ 在线软件 ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ Ⴟᡱ༁ᑕ᥋
ϟ঎ϟ঎԰ 生化试剂জ 植物总 ኏શዶ 提取试剂盒购自天 ᡱʢᑕᤦᔽ঎ᔽᤦዹᡱ঎஦ʢ ᣰ ዹ੫ᔽ᥋ᤦᔽႿ ᣰ Ⴟᡱ༁ᑕᡸᑕࣼᡷᆍቝᑕᡷ঎ᡱ᤟ᥳ ᡱᑕ੫ᔀ ᢉ Ⴟᡱ༁ᑕᡸ
ఋᥘ
根ྉఋ᧧ዶશ᥈ጶશɯ 生物 公 司ᖔ۪ʢᔽቝᔀ୩ዹʢᔽᡱᡷ ኏ఋ ᥘᑕ༁ᡷᔀʢ ༁ᆍᡱቝᑕ঎ ၤᡷቝ᤟ɯ 和 ۪ၤᢃʢᔀ԰ 在线软件 ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ ᣰ ᣰ औऔऔ঎
ᥘᔽ଴ ྉ ۪ᔀʢ஦ᔀዹᡷ ኏ᔀᑕ᤟ ఋᔽቝᔀɯ 反转录试剂盒ܦሕࣕ᥋èࣼ᤟᤟ ༁ᤦ੫঎ᤦᔽᆍ঎ᔽዹ঎ ᑕዹ঎ ࣼҴ ᣰ ᡱၤᢃʢᔀ԰ ᣰ ၤᡷቝ᤟ᣰ ᡱᑕ੫ᔀ঎ ዹ੫ᔽᥳ ᔽʛ ᢉ ᔽႿʛᔀ଴ɯ
ఋᥘ
኏ዶऊጶ ऊᆍʢᔀ ୩ᔀᡷ औᔽᡷၤ ۪ʢᔽቝᔀ୩ዹʢᔽᡱᡷ ኏ఋᑕ༁ᔀ 试剂盒ܦ 分别预测蛋白质二ܦ三级结构ᖔ 使用 ୩ᔽ੫Ⴟᑕ᤟۪ ጢ঎ ԡ
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୩ᥘዶ኏ఋᔀʢ ኏ዶऊጶ ጢࣕ ᣰ ሕࣕ ᣽ᔽᡷ 反转录试剂盒ܦ ୩ᔀʢ׹ᔀʢ ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ ᣰ ᣰ औऔऔ঎ ዹᤦ༁঎ ʛᡷࣼ঎ ʛҴ ᣰ ༁ᔀʢ׹ᔽዹᔀ༁ᣰ ୩ᔽ੫Ⴟᑕ᤟۪ ᣰ ɯ
ᗀ 预测蛋白是否含信号肽ᖔ使用 ۪୩ᨃ኏ఋ 在 线软件
۪ʢᔽቝᔀ୩ఋዶ኏ ᥘᑕ଴ ᧕શዶ ۪ᆍ᤟ᢃቝᔀʢᑕ༁ᔀ 高保真酶ܦ᧕ᓂ ԰
ԡԡԡ ᧕શዶ ቝᑕʢҴᔀʢ 和 ୩ɟା኏ ۪ʢᔀቝᔽ଴ ጶ଴ ఋᑕी 酶均购自 ྉၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ औᆍ᤟஦ᡱ༁ᆍʢᡷ঎ၤ੫ዹ঎ᢼᡱ ᣰ ɯ预测蛋白亚细胞的定位