Page 156 - 《广西植物》2022年第8期

ऐ 期 魏 灵 敏 等 ᧥ 北美鹅掌楸 ᒦᡙዛᤩ᧣ϟ 基因的克隆ܦ表达及其启动子分析 ϟ ࿗ ԡ ጢ
表 ϓই 引物序列
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引物名称 序列 ྉጢࣕͱሕࣕɯ 用途
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ᓂᡷዶ᥈ᨃϟͱè ऊ᥈ఋ᥈᥈ఋ᥈᥈ఋ᥈᥈ዶ᥈᥈ዶఋዶఋऊዶ 中间片段扩增
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ᓂᡷዶ᥈ᨃϟͱ۪ʢᆍͱè ዶఋዶऊऊऊዶ᥈ऊዶ᥈ዶఋዶዶऊ᥈ዶዶ 启动子克隆
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情况ᤥ 在 શऊା᧧ 数据库 ାᓂዶ୩ఋ଴ 中查找同源序列ᖔ 计算并分析基因的相对表达量ᤥ
使用 ऊ᤟ࣼ༁ᡷᑕ᤟ ᣮ 软件分析 ᓂᡷዶ᥈ᨃϟ 蛋白同源性和 ϟ঎԰঎࿗ 构建载体及转化ܓ筛选জ 使用 ᣏᤇᐹʗ ᧧ 和 ̵ᔠႥʐ
ᥘጶ᥈ዶ Ꭾ 软件构建 શᔀᔽ੫ၤᤦᆍʢ᥋ȮᆍᔽႿᔽႿ੫ 系统进化树ᤥ ᎏ 酶分别酶切超表达载体 ۪ା᧧ϟ԰ϟ 质粒ᖔ经电泳跑
使用 ۪᤟ᑕႿᡷऊዶ኏ጶ 数据库 ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ ᣰ ᣰ ᤦᔽᆍᔽႿ஦ᆍʢቝᑕᡷᔽዹ༁঎ 胶确 定 目 标 产物后切胶ᖔ 并回收目的片段
ᡱ༁ᤦ঎ࣼ੫ᔀႿᡷ঎ ᤦᔀ ᣰ औᔀᤦᡷᆍᆍ᤟༁ᣰ ᡱ᤟ᑕႿᡷዹᑕʢᔀ ᣰ ၤᡷቝ᤟ɯ 对克隆得到 ۗʗᅳዛᤩ᧣ϟᤥ 利用诺唯赞同源重组酶将带酶切位点
的启动子序列进行顺式作用元件分析ᤥ 的 ۪ऊ኏ 目的产物构建到酶切后的表达载 体
ϟ঎԰঎ሕ ᒦᡙዛᤩ᧣ϟ 基因的表达分析জ 使用植物总 ኏શዶ ۪ା᧧ϟ԰ϟ 上ᖔ并转入大肠杆菌中扩增ᖔ 获得 ᥈В୩ 表
提取试剂盒分别提取鹅掌楸属不同发育时期的叶 达载体 ۪ା᧧ϟ԰ϟ᥋ۗʗᅳዛᤩ᧣ϟ᥋᥈В୩ᤥ 将经 ۪ऊ኏ܦ酶切及
片及不同组织的总 ኏શዶᖔ并反转录合成 ዹ᧕શዶ 的 测序后鉴定正确的 ᥈В୩ 表达载体质粒转进农杆菌
第一链ᖔ稀释 ԰ԡ 倍后作为 ኏ఋ᥋ी۪ऊ኏ 模板ᤥ 通过 ᥈჆ሕϟԡϟᖔ 并通过花序浸染法 ྉ ऊ᤟ᆍࣼ੫ၤ ᪲ ାᔀႿᡷᖔ
ᨃ᤟ᔽ੫ᆍ Ꭾ 软件设计荧光定量 ۪ऊ኏ 引物ᖔ参考本实验 ϟँँऐɯ转染到野生型拟南芥中ᤥ 将收种得到的 ఋԡ
室鹅掌楸内参基因 ዛዞᡙᔠႥँᎮྉఋࣼ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ԰ԡϟँɯ进行实 代拟南芥种子播种在含 有 ጢԡ ቝ੫ኼ ᓂ 卡那霉素
᥋ϟ
时定量 ी۪ऊ኏ 反应ᖔ引物序列见表 ϟᤥ 反应体系为 ྉ᣽ᑕႿᑕቝᢃዹᔽႿɯ的 ϟᣰ ԰ᥘ୩ 培养基上ᖔ筛选出具有抗卡
԰ԡ ဂᓂᖔ分别为 ୩ɟା኏ ۪ʢᔀቝᔽ଴ ጶ଴ ఋᑕी ֒ϟԡ ဂᓂᖔ上下 那霉素的转基因植株ᖔ利用启动子测序引物对 ఋϟ
᥋ϟ 代拟南芥叶片的 ᧕શዶ 进行 ۪ऊ኏ 鉴定ᖔ以野生型植
游引物 各 ԡ঎ ࿗ ဂᓂ ྉ ጢ ဂቝᆍ᤟ኼ ᓂ ɯᖔ ኏ᨃᣮ ኏ᔀ஦ᔀʢᔀႿዹᔀ
᧕ᢃᔀ ᆍʢ ᧕ᢃᔀ ֒ԡ঎࿗ ဂᓂᖔ模板ྉϟԡԡ Ⴟ੫ɯ԰ ဂᓂᖔ኏શዶᑕ༁ᔀ᥋ 株为阴性对照ᤥ 将符合预期结果的转基因植株继
஦ʢᔀᔀ ʛʛ̀ ԡᤃ঎ऐ ဂᓂᤥ 扩增程序᧥ँጢ ቩ 预变性 ሕԡ ༁ଫ 代筛选至 ఋ԰ 代ᖔ用于 ᥈В୩ 染色分析ᤥ
԰
ँጢ ቩ 变性 ጢ༁ᖔᤃԡቩ 退火 ሕ࿗ ༁ᖔ࿗ԡ 个循环ᤥ 试验进 ϟ঎԰঎ጢ 转基因拟南芥植株表型观察জ 转基因株系
ͱσσዹᡷ 和野生型拟南芥的种子先后经 Ꭾጢᠮ 酒精ܦϟԡᠮ 次
行 ሕ 次生物学重复ᖔ用 ԰ 法ྉᓂᔽ׹ᑕҴ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ԰ԡԡϟɯ