Page 170 - 《广西植物》2022年第8期
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ऐ 期 王卓为等᧥ 紫玉兰ጸ红元宝ᆥ᤹ᤀሕᤩ௴ϟ 基因的克隆及表达分析 ϟ ࿗ ϟ ँ
组前期研究显示ᖔ紫玉兰和紫玉兰ጸ红元宝ᆥ花被片 શʢྉႿᆍႿ᥋ʢᔀʛࣼႿʛᑕႿᡷ ᡱʢᆍᡷᔀᔽႿ ʛᑕᡷᑕᤦᑕ༁ᔀɯ数据库的基因注
中均含有 ࿗ 种在 ऊሕ 位芸香糖苷修饰的花青素苷ᖔ 释进行筛选ᖔ对得到的序列 ऊᓂሕሕऐऐऊᆍႿᡷᔽ੫ϟ 进一步
即 矢车菊素 ሕ᥋ᨃ᥋芸香糖苷᥋ጢ᥋ᨃ᥋葡萄糖苷 通过 શऊା᧧ 的 ାᓂዶ୩ఋ 功能 ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ ᤦᑕ༁ᡷ Ⴟዹᤦᔽ
ྉऊᢃሕࣼጢ᥈ɯܦ矢车菊素 ሕ᥋ᨃ᥋芸香糖苷ྉऊᢃሕࣼɯܦ芍 ႿቝႿᔽၤ੫ᆍ ᣰ ାᑕ༁ᡷዹ੫ᔽɯ 进行 ᤦᑕ༁ᡷ 比对ᤥ 在开放阅读
药素 ሕ᥋ᨃ᥋芸香糖苷᥋ጢ᥋ᨃ᥋葡萄糖苷ྉ۪Ⴟሕࣼጢ᥈ɯܦ芍药 框ྉᆍᡱᔀႿ ʢᔀᑕʛᔽႿ੫ ʢᑕቝᔀᖔ ᨃèɯ 框的两侧使用 ۪ʢᔽቝᔀ
素 ሕ᥋ᨃ᥋芸香糖苷ྉ۪Ⴟሕࣼɯ ྉۼᑕႿ੫ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡϟँɯᤥ 花 ۪ʢᔽቝᔀ ጢԡ 软件设计引物ྉ表 ϟɯᖔ引物由杭州有康生
青素的 ऊሕ 位芸香糖苷化修饰分两步完成ᖔ首先在 物技术有限公司合成ᤥ 将紫玉兰ጸ红元宝ᆥ 花发育
ሕ᥈ఋ 作用下 ऊሕ 位发生 ᨃ᥋葡萄糖基化ᖔ随后鼠李糖 的 ୩ϟጲ ୩ጢ 共 ጢ 个时期的 ዹ᧕શዶ 等量混匀ᖔ稀释 ϟԡ 倍
转移酶ྉሕ᥋ᨃ᥋ʢၤᑕቝႿᆍ༁ᢃᡷʢᑕႿ༁ᔀʢᑕ༁ᔀᖔሕఋɯ 才可以转移 作为模板ᖔ进行 ఋ᥋۪ऊ 扩增ᤥԡ ဂᓂ ۪ऊ 反应体
ᨃ᥋鼠李糖苷与 ᨃ᥋葡萄糖苷相连形成芸香糖苷基团 系如下᧥上下游引物ྉϟԡ ဂቝᆍኼᓂ ɯ 各 ϟ ဂᓂᖔዹ᧕શዶ
᥋ϟ
ྉɟᑕቝᑕझᑕҴᔽ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡԡɯᤥ 由此推测紫玉兰ጸ 红元 模板 ϟ ဂᓂᖔ۪ʢᔀቝᔽ ఋᑕी ϟԡ ဂᓂᖔʛʛ̀ ᨃᎮ ဂᓂᤥ 反应程
宝ᆥ花色形成过程中ᖔሕᤩ௴ 基因对 ࿗ 种花青素苷的合 序᧥ँጢ ቩ预变性 ጢቝᔽႿ 后运行 ሕጢ 个循环ྉँጢ ቩ变性
成具有重要作用ᤥ 为进一步揭示其功能ᖔ本研究基 ሕԡ ༁ᖔጢँᤃ ቩ ሕԡ༁ᖔᎮቩ ቝᔽႿɯଫᎮ ቩ ϟԡቝᔽႿᖔϟԡቩ
于转录组数据ᖔ筛选出 ሕᤩ௴ 基因ᖔ并对其进行克隆 ጢቝᔽႿᤥ ۪ऊ 反应结束后ᖔ通过 ϟᠮྉऔ ᣰ ɯ 琼脂糖凝
和表达分析ᖔ研究结果为木兰属植物花色形成机理 胶电 泳分离 目 的 片 段ᤥ 切胶后ᖔ 使用 ఋᑕᑕᑕ
研究提供重要依据ᤥ ᥘᔽႿᔽାጶ୩ఋ ዶ੫ᑕʢᆍ༁ᔀ ᥈ᔀ ᧕શዶ ጶᡷʢᑕዹᡷᔽᆍႿ ᔽᡷ ᔀʢ ࿗ ԡ
ྉఋᑕᑕᑕ ዹᆍʛᔀ᧥ શᆍँᎮᤃɯ试剂盒按照使用说明书进
ϟজ 材料与方法 行胶回收ᤥ 回收后ᖔ 取适量的回收产物连接至
ᡱᥘ᧕ ϟऐ᥋ఋ ᔀዹᡷᆍʢྉ ఋᑕᑕᑕ ዹᆍʛᔀ᧥ શᆍᤃԡϟϟɯᤥ 连接
ఋᥘ
ϓॹϓ 试验材料 产物转化大肠杆菌 ጛዞ၊ᓣʗᔠዞ၊ᔠᐹ ዞᅳᔠᤀ ᧕̀ጢም ऊᆍቝᡱᔀᡷᔀႿᡷ
紫玉兰ጸ红元宝ᆥ十年生实生苗种植于浙江农 ऊᔀ༁ྉఋᑕᑕᑕ ዹᆍʛᔀ᧥ શᆍ ँԡጢᎮɯᖔ蓝白斑筛选后挑单
林 大学平山试验基地 ྉ ϟϟँ ࿗ࣕ ጢ࿗ ᤃᎮ× ጶܦ 克隆进行菌落 ۪ऊ 鉴定ᖔ条带正确的送至杭州有康
ሕԡϟጢࣕጢԡԡँ× શɯᖔ选择生长健壮且无病虫害的植 生物技术有限公司进行 ᧕શዶ 测序ᤥ
株ᖔ于 ԡϟँ 年 ࿗ 月采取花蕾期ྉᤦࣼʛ ᡱᔀʢᔽᆍʛɯ ྉ ୩ϟɯܦ
露色 期 ྉ ʛᔀऔ ዹᆍᆍʢ ᡱᔀʢᔽᆍʛɯ ྉ ୩ɯܦ 初开期 ྉ ᔽႿᔽᡷᔽᑕ 表 ϓই 紫玉兰ጝ红元宝ᆋ᤹ᤀᇺᤩ௴ϓ 基因
克隆及实时荧光定量引物
ᆍऔᔀʢᔽႿ੫ ᡱᔀʢᔽᆍʛ ɯ ྉ ୩ሕ ɯܦ 半开期 ྉ ၤᑕ᥋ᆍऔᔀʢᔽႿ੫
ఋᑕᤦᔀ ϟজ ۪ʢᔽቝᔀʢ༁ ᆍʢ ዹᆍႿᔽႿ੫ ᑕႿʛ ʢᔀᑕ᥋ᡷᔽቝᔀ ीࣼᑕႿᡷᔽᡷᑕᡷᔽᔀ
ᡱᔀʢᔽᆍʛɯྉ୩࿗ɯܦ盛开期ྉ ࣼᢃ᥋ᆍऔᔀʢᔽႿ੫ ᡱᔀʢᔽᆍʛɯ ྉ ୩ጢɯ ጢ
۪ऊ ᆍ ᤹ᤀሕᤩ௴ϟᔽႿ ᤹ᐹႥᅳᤀᔠᐹ ᤀᔠᤀᔠஏᤀᅳʗᐹ ጸ̀ᆍႿ੫ᢃࣼᑕႿᤦᑕᆍᆥ
个时期的最外轮花瓣ྉ 图 ɯᖔ锡纸包裹ᖔ液氮速冻
固样ᤥ 由于紫玉兰ጸ 红元宝ᆥ 为花叶同放ᖔ同时采 引物名称 序列ྉጢࣕ᥋ሕࣕɯ 用途
۪ʢᔽቝᔀʢ
集根ܦ茎ܦ老叶ܦ嫩叶等组织部位的样品ᖔ保存于 Ⴟᑕቝᔀ ୩ᔀीࣼᔀႿዹᔀ ྉጢࣕ᥋ሕࣕɯ èࣼႿዹᡷᔽᆍႿ
ͱऐԡ ቩ 冰箱ᖔ用于 શዶ 提取和荧光定量分析ᤥ
᤹ᤀሕᤩ௴ϟ᥋è ఋዶऊऊऊऊዶዶዶऊऊऊऊዶఋऊऊऊዶऊऊ 扩增 ᨃè
ϓॹԣ 总 ቴટዛ 的提取ܓ检测与 ዞᦵટዛ 的合成 ᤹ᤀሕᤩ௴ϟ᥋ ऊఋఋऊఋఋऊऊ᥈ऊఋఋऊఋఋ᥈ऊऊऊዶఋ ఋᆍ ᑕቝᡱᔽᢃ ᨃè
᤹ᤀሕᤩ௴ϟ᥋ ᥈ዶऊऊ᥈ऊఋఋऊ᥈ऊऊऊዶऊዶዶዶ 实时荧光定量
使用 诺禾致源 ВᡷʢᑕऊᔀᑕႿ ۪ᆍᢃ༁ᑕዹዹၤᑕʢᔽʛᔀ ᑕႿʛ
ी۪ऊ᥋è ᔀᑕ᥋ᡷᔽቝᔀ
ᡱၤᔀႿᆍ ۪ᑕႿᡷ શዶ ۪ࣼʢᔽᔽዹᑕᡷᔽᆍႿ ᔽᡷ ྉ ᧕શዶ ʢᔀᔀɯ શዶ ᤹ᤀሕᤩ௴ϟ᥋ ऊዶዶఋऊऊऊఋऊऊऊఋऊ᥈ऊऊఋఋऊఋ ीࣼᑕႿᡷᔽᡷᑕᡷᔽᔀ
ी۪ऊ᥋ ۪ऊ
提取试剂盒ྉશ̀Вऊԡԡ୩ɯᖔ提取紫玉兰 ጸ 红元宝ᆥ
᤹ᤇ௴ጛÞ᥋è ዶ᥈᥈ఋఋ᥈ዶ᥈ዶዶఋ᥈᥈ఋ᥈ዶ᥈ዶऊఋ᥈ఋ 扩增内参基因
୩ϟጲ ୩ጢ 时期花瓣和根ܦ茎ܦ老叶ܦ嫩叶等组织部位的 ᤹ᤇ௴ጛÞ᥋ ఋऊዶऊ᥈ऊዶऊ᥈᥈ዶዶఋऊዶఋఋዶऊዶఋఋ ఋᆍ ᑕቝᡱᔽᢃ
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总 શዶᤥ 使用 ۪ʢᔽቝᔀ୩ዹʢᔽᡱᡷ ఋ ᥘᑕ༁ᡷᔀʢ ᥘᔽ ྉ۪ᔀʢᔀዹᡷ
ᔀᑕ ఋᔽቝᔀɯ ྉఋᑕᑕᑕ ዹᆍʛᔀ᧥ ԡሕᤃዶɯ进行反转录反
应ᤥ 反转录后得到的 ዹ᧕શዶ 保存在ͱԡ ቩ冰箱备用ᤥ ϓॹ ᤹ᤀᇺᤩ௴ϓ 基因的生物信息学分析
ϓॹᇺ ᤹ᤀᇺᤩ௴ϓ 基因克隆 使用 ୩Ⴟᑕᡱ᥈ᔀႿᔀ ࿗ϟऐ 软件去除载体序列ᖔ获得
利用本课题组前期构建的紫玉兰ጸ红元宝ᆥ 花 目的基因序列ଫ使用 ᧕ዶશᥘዶશ Ꭾԡ 软件将核苷酸
瓣转录组数据库ྉ 结果未发表ɯᖔ以 ᑕႿᡷၤᆍዹᢃᑕႿᔽʛᔽႿ ᣰ 序列翻译成蛋白质序列ଫ利用 શऊା᧧ 提供的 ᨃè
ᑕᆍႿᆍᔽʛ ሕ᥋ᨃ᥋੫ࣼዹᆍ༁ᢃᡷʢᑕႿ༁ᔀʢᑕ༁ᔀ 为检索词ᖔ对注释到 ᔽႿʛᔀʢ ྉၤᡷᡷᡱ༁᧥ ᣰ ᣰ औऔऔႿዹᤦᔽႿቝႿᔽၤ੫ᆍ ᣰ ᆍʢᔽႿʛᔀʢ ᣰ ɯ分
