Page 66 - 《广西植物》2023年第1期

６ ２ 广 西 植 物 ４３ 卷
洋化工ꎬＧＦ２５４)ꎬ制备 Ｃ 色谱柱 (ＹＭＣ￣Ｐａｃｋ ＯＤＳ￣ ２.３ ＨＰＬＣ 分析
１８
Ａꎬ ２５０ ｍｍ × ２０ ｍｍꎬ ５ μｍꎬ ＹＭＣ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄꎬ Ｋｙｏｔｏꎬ 采 用 ＨＰＬＣ 对 活 性 较 好 的 乙 酸 乙 酯 层
Ｊａｐａｎ)ꎬ甲醇(色谱纯ꎬ麦克林)ꎬ其他常规试剂(分 (ＰＰＮＥ) 进 行 分 析ꎮ 色 谱 条 件: 色 谱 柱 Ｋｒｏｍａｓｉｌ
析纯ꎬ国药集团)ꎮ 小鼠黑色素瘤细胞株 Ｂ１６(武汉 １００－５－Ｃ１８ 柱(４.６ ｍｍ × ２５０ ｍｍ)ꎬ检测波长为

博士德)ꎬ人黑色素瘤细胞株 Ａ３７５(武汉博士德)ꎬ ２７６ ｎｍꎬ流动相(０.１ ％甲酸 Ａ ~ 乙腈 Ｂ)ꎬ流速为 １
ＣＣＫ８ 试剂盒( 上海生工)ꎬＤＭＳＯ( Ｂｉｏｓｈａｒｐ)ꎬ胎牛 ｍＬｍｉｎ ꎬ进样体积为 ５ μＬꎬ采用梯度洗脱ꎬ平衡
￣１
血清( Ｇｉｂｃｏ)ꎬ培养基 ＲＰＭＩ￣１６４０ ( ＨｙＣｌｏｎｅ)ꎬ胰酶 柱子采用 １５ ％ Ｂꎮ 洗脱过程为 ０ ~ ５ ｍｉｎꎬ３０％ Ｂꎻ

(Ｇｉｂｃｏ)ꎮ ５ ~ １０ ｍｉｎꎬ３０％ ~ ４０％ꎻ１０ ~ ２０ ｍｉｎꎬ４０％ Ｂꎻ２０ ~ ３０
ｍｉｎꎬ４０％ ~ ５０％ Ｂꎻ４０ ~ ４５ ｍｉｎꎬ ５０％ ~ ６０％ Ｂꎻ４５ ~
２ 实验方法 ５０ ｍｉｎꎬ ６０％ ~ ９８％ Ｂꎻ５０ ~ ５５ ｍｉｎꎬ９８％ Ｂꎻ５５ ~ ６０

ｍｉｎꎬ１５％ Ｂꎮ ＰＰＮＥ 的 ＨＰＬＣ 如图 ２ 所示ꎮ
２.１ 提取和分离
将新鲜婆婆纳全草晾干ꎬ取 １ ｋｇ 干燥全草粉
碎ꎬ用 ９０％乙醇室温浸提 ３ 次ꎬ每次 ７２ ｈꎬ合并提
取浸提液ꎬ减压浓缩至无醇味ꎬ加纯水稀释粉碎ꎬ
最终体积为 １ Ｌꎮ 经水分散后的提取物依次用石
油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取ꎬ少量多次ꎬ至萃取液
颜色变淡为止ꎬ减压回收萃取溶剂ꎬ得 ７.７ ｇ 的石
油醚层、１３.３０ ｇ 的乙酸乙酯层、９.３０ ｇ 的正丁醇
层、２５.４６ ｇ 的水层样品ꎮ
通过活性评价发现ꎬ乙酸乙酯层样品即乙酸
乙酯萃取部位( ＰＰＮＥ) 较其他样品具有突出的抑
制黑色素瘤细胞 Ｂ１６ 和 Ａ３７５ 的活性ꎬ对 ＰＰＮＥ 样
品进行系统的分离纯化ꎮ 取 ＰＰＮＥ(１２.５６ ｇ) 样品
用适量甲醇溶解ꎬ经 ０.４５ μｍ 微孔滤头过滤ꎬ反向 图 １ 婆婆纳的分离纯化流程图
Ｆｉｇ. １ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｌｏｗ
硅胶(ＯＤＳ) 拌样ꎬ以甲醇 ∶ 水(１ ∶ １ ~ １ ∶ ０) 为洗
ｃｈａｒｔ ｏｆ Ｖｅｒｏｎｉｃａ ｄｉｄｙｍａ
脱剂进行 ＯＤＳ 柱层析ꎬ经高效液相色谱( ＨＰＬＣ)
和薄层色谱( ＴＬＣ) 检测ꎬ合并馏分ꎬ得 Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ 五个部分ꎮ Ａ 部分ꎬ采用葡聚糖凝胶柱( ＨＬ￣２０ꎬ
洗脱剂为甲醇和水系统) 进行反复的柱层析ꎬ得化
合物 １(４５ ｍｇ)和化合物 ２(３９ ｍｇ)ꎮ Ｂ 部分ꎬ采用
葡聚糖凝胶柱(ＨＬ￣２０ꎬ洗脱剂为甲醇和水系统) 进
行反复的柱层析ꎬ得化合物 ５(１９ ｍｇ)ꎮ Ｃ 部分ꎬ采
用葡聚糖凝胶柱(ＨＬ￣２０ꎬ洗脱剂为甲醇和水系统)
进行反复的柱层析ꎬ得化合物 ６(１５ ｍｇ)ꎬ分别合并
凝胶柱层析后含有化合物 ３ 和化合物 ４ 的馏分ꎬ采
用半制备色谱进行制备( 检测波长为 ２５４ ｎｍꎬ甲
醇 ∶ 水为 ５５ ∶ ４５)ꎬ制备后采用凝胶柱层析纯化得 图 ２ 乙酸乙酯萃取部位的 ＨＰＬＣ 图
化合物 ３(２１ ｍｇ)和化合物 ４(１９ ｍｇ)ꎮ Ｅ 部分ꎬ采 Ｆｉｇ. ２ ＨＰＬＣ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｌａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔ (ＰＰＮＥ)

用葡聚糖凝胶柱(ＨＬ￣２０ꎬ洗脱剂为甲醇和水系统)
柱层析后ꎬ采用半制备色谱进行制备[ 检测波长为 ２.３ 细胞培养
２５４ ｎｍꎬ甲醇 ∶ 水(６５ ∶ ３５)]ꎬ制备后采用凝胶柱 细胞接种于直径为 ６ ｃｍ 的细胞培养皿中ꎬ用

层析纯化得化合物 ７(３５ ｍｇ)ꎮ 含 １０％胎牛血清、１％双抗的 ＲＰＭＩ￣１６４０ 培养基在