Page 74 - 《广西植物》2023年第1期
P. 74
７ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
根各约 ５ ｇꎬ用自来水冲洗干净后ꎬ用滤纸吸干表
１ 材料与方法 面水分ꎬ剪成小片( 叶片) / 段( 茎和根) 放入灭菌
平皿中ꎬ用无菌水洗涤 ３ 次并吸干ꎮ 用 ７５％ 乙醇
１.１ 材料 浸泡叶片 ３０ ｓꎬ茎段和根 ６０ ｓꎮ 无菌水浸泡冲洗 ５
供 试 样 品 蕲 艾 ( Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｒｇｙｉ ｖａｒ. ａｒｇｙｉ 次并吸干ꎬ用 ２.５％次氯酸钠溶液浸泡叶片 ２ ｍｉｎꎬ
‘Ｑｉａｉ’):采自湖北省黄冈市蕲春县赤东镇三渡村 ５％次氯酸钠溶液浸泡茎段和根 ３ ｍｉｎꎬ无菌水浸泡
五组大田种植ꎬ样品采集后用自封袋密封后马上 ２ ｍｉｎꎬ循环 ３ 次ꎬ用无菌滤纸吸干残留的水分ꎮ 吸
回实验室进行内生细菌的分离ꎮ 取最后一次漂洗的无菌水 ２００ μＬ 涂布于 ＬＢ 培养
供试菌株:大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)、金黄色 基平板ꎬ验证消毒效果ꎮ
葡 萄 球 菌 ( Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ)、 产 气 肠 杆 菌 将消毒好的组织样品放入无菌研钵中ꎬ向其
(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ)、 枯 草 芽 孢 杆 菌 ( Ｂａｃｉｌｌｕｓ 内加入 ９ ｍＬ 无菌生理盐水和无菌石英砂ꎬ研磨至
ｓｕｂｔｉｌｉｓ)、变形杆菌(Ｐｒｏｔｅｕｓｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ) 和小肠 成匀浆状ꎬ１００ 倍梯度稀释ꎬ取 ２００ μＬ 的适当梯度
结肠炎耶尔森氏菌( Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ) 均保存 稀释液至 ＬＢ 固体培养平板上ꎬ均匀涂布ꎬ分别置
于黄冈师范学院经济林种质资源改良与综合利用 于 ２８ ℃ 和 ３７ ℃ 培养ꎮ 挑选菌落形态不同的单菌
湖北省重点实验室ꎮ 落纯化ꎬ并将形态大部分相似的菌落划归为同一
培养基:ＬＢ 固体及液体培养基(１ Ｌ) ( 蛋白胨 类ꎬ保存菌株备用ꎮ
１０ ｇꎬ酵母提取物 ５ ｇꎬＮａＣｌ １０ ｇꎬｐＨ ７.０ꎬ固体加琼脂 １.２.２ 生理生化特征测定 参照« 微生物学实验教
粉 １８ ｇ)用于蕲艾不同组织内生细菌的分离扩繁ꎮ 程»(周德庆和徐德强ꎬ ２０１３)ꎬ采用平板划线法分
淀粉培养基(１ Ｌ)(牛肉膏 ５ ｇꎬ蛋白胨 １０ ｇꎬＮａＣｌ ５ 离得到内生细菌单菌落ꎬ记录菌落的颜色、形态、
ｇꎬ可溶性淀粉 ２ ｇꎬｐＨ ７.０ ~ ７.２ꎬ琼脂 １８ ｇ)、牛奶培 透明度等ꎬ并在显微镜下观察其形态特征及革兰
养基 ( ＬＢ 固体培养基中加入 １１％ 灭菌的脱脂奶 氏染色反应ꎮ 参考« 常见细菌系统鉴定手册» ( 东
粉)、刚果红培养基(１ Ｌ)(羧甲基纤维素钠 １５ ｇꎬ蛋 秀珠和蔡妙英ꎬ ２００１) 测定筛选菌株的生理生化
白胨 ５ ｇꎬＫＨ ＰＯ ２.０ ｇꎬＭｇＳＯ ０.２ ｇꎬＮａＣｌ ５ ｇꎬ琼脂 反应ꎮ 此外ꎬ挑取活化后的内生细菌ꎬ分别在含淀
２ ４ ４
１８ ｇꎬ刚果红 ０.２ ｇꎬｐＨ ７.０)和油脂培养基(ＬＢ 固体 粉培养基平板、牛奶培养基平板、刚果红培养基平
培养基加入 １％吐温 ８０)分别用来筛选产淀粉酶、蛋 板和油脂培养基平板上划线ꎬ３７ ℃ 培养 １ ~ ２ ｄ 后ꎬ
白酶、纤维素酶和脂肪酶的内生细菌ꎮ 蛋白胨水培 在淀粉培养基平板上平铺一层卢戈氏碘液ꎬ其余
养基(１ Ｌ)(蛋白胨 １０ ｇꎬＮａＣｌ １５ ｇꎬｐＨ ７.３~７.５)、蔗 平板不做处理ꎬ分别观察淀粉平板、牛奶平板和刚
糖/ 葡萄糖发酵培养液[蛋白胨水培养基 １ Ｌꎬ１.６％ 果红平板上菌落周围的透明水解圈ꎬ以及吐温 ８０
溴甲酚紫乙醇溶液 １.５ ｍＬꎬ２０％蔗糖溶液(蔗糖发 平板上的白色晕圈ꎬ测量并计算透明水解圈和白
酵)ꎬ２０％葡萄糖溶液(葡萄糖发酵)]、葡萄糖蛋白 色晕圈与菌落直径的比值ꎮ
胨水培养液(１ Ｌ) (葡萄糖 ５ ｇꎬ蛋白胨 ５ ｇꎬＫ ＨＰＯ １.２.３ １６Ｓ ｒＤＮＡ 分子生物学鉴定 提取筛选菌株
２ ４
２ ｇꎬｐＨ ７.２~７.４)、明胶液化培养基(１ Ｌ) (蛋白胨 ５ 的染色体总 ＤＮＡꎬ以菌株的总 ＤＮＡ 为模板ꎬ利用通
ｇꎬ明胶 １００~１５０ ｇꎬｐＨ ７.２ ~７.４)和柠檬酸盐培养基 用引物对 ２７Ｆ:５′￣ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ￣３′和
(１ Ｌ) [柠檬酸钠 ２ ｇꎬＫ ＨＰＯ １ ｇꎬＮＨ Ｈ ＰＯ １ ｇꎬ １４９２Ｒ: ５′￣ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ￣３′ 扩 增 菌 株 １６ｓ
２ ４ ４ ２ ４
ＮａＣｌ ５ ｇꎬＭｇＳＯ ０.２ ｇꎬ琼脂 １８ ｇꎬ１％溴麝香草酚蓝 ｒＤＮＡ 基因ꎮ ２５ μＬ 的反应体系:模板 １ μＬꎬ上、下游
４
(酒精溶液) １０ ｍＬꎬｐＨ ６.８] 分别用来进行吲哚试 引物 各 １ μＬꎬ ｄｄＨ Ｏ ９. ５ μＬꎬ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶
２
验、蔗糖/ 葡萄糖发酵试验、乙酰甲基甲醇试验(ＶＰ Ｍｉｘ１２.５ μＬꎮ ＰＣＲ 反应条件:９４ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎬ９４
试验) / 甲基红试验(ＭＲ 试验)、明胶水解试验和柠 ℃变性 ３０ ｓꎬ５５ ℃退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎꎬ共 ３０
檬酸盐试验ꎮ 个循环ꎬ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 取 ＰＣＲ 产物于 １％的琼
１.２ 方法 脂糖凝胶上电泳ꎬ根据试剂盒操作说明回收 ＤＮＡ 片
１.２.１ 内生菌的分离纯化 参照专利“ 一种艾草内 段ꎬ回收后的片段委托上海生工生物工程有限公司
生菌的分离方法”分离蕲艾根、茎和叶的内生细菌 测序ꎮ 根据测序结果ꎬ将序列在 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ(ｈｔｔｐｓ:/ /
(徐碧林等ꎬ ２０１９)ꎮ 取健康、无病害的艾叶、茎和 ｗｗｗ.ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ.ｎｅｔ/ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ/ １６ｓ＿ｄｏｗｎｌｏａｄ)数据库中
