Page 111 - 《广西植物》2023年第2期

２ 期 陈博雯等: 基于转录组的八角挥发油合成相关基因挖掘与分析 ３ ０ ５

本研究以挥发油含量与组分差异显著的优良 进行分析ꎬ具体分析条件为:ＨＰ￣ＦＦＡＰ 柱(３０ ｍ ×
无性系桂角 ６９ 号与普通品种砧 ０１ 号为研究对象ꎬ ３２０ μｍ × ０.５ μｍ)ꎬ柱温 ６０ ℃ ꎬ汽化室 ２５０ ℃ ꎬ检
采用高通量测序技术对两个品种叶片进行转录组 测室 ３００ ℃ ꎬ２ ℃ ｍｉｎ 程序升温 ６０ ℃ (１ ｍｉｎ)至
￣１
测序ꎬ通过转录组组装、注释、ＧＯ 分类和 ＫＥＧＧ 通 ２２０ ℃ (２０ ｍｉｎ)ꎬ进样量 ０.２ μＬꎬ分流比 １００ ∶ １ꎬ
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路分析等方法对叶片中差异表达基因进行挖掘ꎬ 载气流速 １.０ ｍＬｍｉｎ ꎮ 采用面积归一化法计算
拟探讨以下问题:(１)挥发油表型差异显著的两品 挥发油 组 分 含 量ꎮ 试 验 均 重 复 ３ 次ꎬ 使 用 ＳＰＳＳ
种在转录水平上有哪些差异ꎻ(２) 这些差异表达的 １９.０ 软件进行分析ꎮ
基因参与哪些生物学过程、代谢通路ꎬ其中有哪些 １.２.２ ＲＮＡ 提取及转录组测序 取叶片使用 ＴＲＺｏｌ
与挥发油合成相关ꎮ 本研究有助于深入发掘八角 Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ 总 ＲＮＡ 提取试剂盒( 天根) 按说明书操
挥发油合成相关的关键基因ꎬ为下一步八角分子 作提取总 ＲＮＡꎮ ＲＮＡ 的完整性通过凝胶电泳的方
设计育种提供候选基因ꎮ 法检 测ꎬ ＲＮＡ 的 浓 度 及 纯 度 通 过 使 用 ＮａｎｏＤｒｏｐ
ＮＤ￣２０００ 进行检测ꎮ 检测合格后的 ＲＮＡ 样品送至
１ 材料与方法 华 大 基 因 公 司 进 行 ｃＤＮＡ 文 库 构 建 并 使 用

ＢＧＩＳＥＱ￣５００ 平台测序ꎮ
１.１ 材料 １.２.３ 转录本组装及注释 将测序得到的原始数
供试材料为八角优良无性系桂角 ６９ 号和普通 据使 用 Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ 进 行 过 滤 得 到 Ｃｌｅａｎ Ｒｅａｄｓ
品种砧 ０１ 号的 １５ 年生苗木ꎬ采自广西林科院八角 (Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４)ꎬ使用 Ｔｒｉｎｉｔｙ 软件进行组装
种质资源收集圃ꎮ 砧 ０１ 号叶片椭圆形ꎬ叶尖 渐 ( Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 使用 Ｔｇｉｃｌ 软件将组装好的转
尖ꎻ桂角 ６９ 号叶片椭圆形ꎬ叶尖凸尖(图 １)ꎮ 选择 录 本 进 行 聚 类 除 去 冗 余 以 提 高 Ｕｎｉｇｅｎｅ 质 量
１０ 月中旬晴朗天气采样ꎬ在树冠外围东、西、南、北 (Ｍｅｈｒａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ 对供试材料的 ６ 个样品转

４ 个方向各采集成熟、完整、无病虫害叶片 １５ 片ꎬ 录本进行分析ꎬ桂角 ６９ 号的 ３ 个生物学重复分别
混合后置于液氮中速冻带回实验室保存ꎬ用于挥 为标记为 Ｇｕｉｊｉａｏ ６９＿１、Ｇｕｉｊｉａｏ ６９＿２ 和 Ｇｕｉｊｉａｏ ６９＿
发油检测及转录组测序ꎮ ３ꎬ砧 ０１ 号的 ３ 个生物学重复标记为 Ｚｈｅｎ ０１＿１、
Ｚｈｅｎ ０１＿２ 和 Ｚｈｅｎ ０１＿３ꎮ
将得到的 Ｕｎｉｇｅｎｅ 序列使用 ＢＬＡＳＴ、Ｂｌａｓｔ２ＧＯ、
ＨＭＭＳＣＡＮ 软件( Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９７ꎻＢｕｃｈｆｉｎｋ ｅｔ
ａｌ.ꎬ ２０１５)与 ＥｕＫａｒｙｏｔｉｃ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ (ＫＯＧ)、
Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ、ＮＲ、ＮＴ、Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ
Ｇｅｎｏｍｅｓ (ＫＥＧＧ)、Ｐｆａｍ、Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ (ＧＯ)７ 个数
据库进行对比ꎬ分析获得基因的注释信息ꎮ
１.２.４ 差异表达基因分析 使用 ＲＳＥＭ 对各个样品
的 基 因 表 达 水 平 进 行 比 对 计 算 ( Ｌｉ ＆ Ｄｅｗｅｙꎬ
２０１１)ꎬ依据基因表达水平进行样本相关性及 ＰＣＡ
Ａ. 砧 ０１ 号ꎻ Ｂ. 桂角 ６９ 号ꎮ 下同ꎮ
分析ꎮ 采用 ＤＥＳｅｑ(Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４) 对差异表达
Ａ. Ｚｈｅｎ ０１ꎻ Ｂ. Ｇｕｉｊｉａｏ ６９. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
基因进行分析ꎬ过滤掉平均表达量<０.５ 的基因后ꎬ
图 １ 砧 ０１ 号与桂角 ６９ 号叶片形态 按照 Ｑ 值<０.０５ 和 ｌｏｇ ｜ Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ ｜ ≥１ 的标准筛
２
Ｆｉｇ. １ Ｌｅａｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｚｈｅｎ ０１ ａｎｄ Ｇｕｉｊｉａｏ ６９
选差异基因ꎬ并对差异基因分别进行 ＧＯ 富集分析
和 ＫＥＧＧ 通路富集分析ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 挥发油提取及测定 称取鲜叶装入圆底烧 ２ 结果与分析
瓶中ꎬ连接挥发油提取器和冷凝器ꎬ蒸馏速率控制
在 ２ ~ ３ ｍＬ１００ ｍｉｎ ꎬ蒸馏至挥发油不再增加后 ２.１ 叶片挥发油含量及组分分析
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停止加热ꎬ冷却 １０ ｍｉｎꎬ读取刻度管中挥发油毫升 两品种叶片的挥发油气相色谱检测结果显示
数ꎬ计算挥发油含量ꎮ 其主成分差异较大ꎬ桂角 ６９ 号主成分为草蒿脑ꎬ
取挥发油按照 ＧＢ / Ｔ １５０６８—２００８« 八角茴香 砧 ０１ 号则为反式茴香脑( 图 ２)ꎮ 桂角 ６９ 号中挥
(精)油» 所述方法使用 Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０Ｎ 气相色谱仪 发油的总量和草蒿脑组分的含量都显著高于砧 ０１