Page 124 - 《广西植物》2023年第2期

３ １ ８ 广 西 植 物 ４３ 卷
表 １ 表达载体构建的特异引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
引物名称 引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＰｔＣＨＩ￣Ｆ ＧＡＴＣＧＡＡＡＣＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣＡ
ＰｔＣＨＩ￣Ｒ ＡＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧ
ＰｔＣＨＩ￣ＤＬＦ ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣ
ＰｔＣＨＩ￣ＤＬＲ ＣＧＡＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＴＴＴＡ
ＰｔＣＨＩ￣ＹＨＦ ｃａｇｃａａａｔｇｇｇｔｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ
ＰｔＣＨＩ￣ＹＨＲ ｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇａｇ
ＧＡＣＴＡＴＡＡＴＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＴＡＣ
ＰｔＣＨＩ￣ＹＸＢＦ ｇｇｔｃｃｇｇａｃｔｃａｇａｔｃｔｃｇａｇＣＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡ
ＰｔＣＨＩ￣ ｇｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｇａｔｃｃｃｇｇｇ
ＹＸＢＲ ＧＡＣＴＡＴＡＡＴＧＣＣＧＴＧＧＣＴＣＡＡＴＡＣ

Ｍ. ＤＬ２０００ ＤＮＡ 标记ꎻ １. ＰｔＣＨＩ 基因的 ＰＣＲ 扩增产物ꎮ
Ｍ. ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ １. ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰｔＣＨＩ ｇｅｎｅ.
图 ２ 粉葛 ＰｔＣＨＩ 基因的 ＰＣＲ 扩增
Ｆｉｇ. ２ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｔＣＨＩ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
Ｐｕｅｒａｒｉａ ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ. ｔｈｏｍｓｏｎｉｉ

∗∗表示在 ０.０１ 水平上差异显著ꎮ
为 ５.３４ꎬ不稳定指数为 ３２.２５ꎬ属于稳定蛋白ꎬ脂肪
∗∗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０.０１ ｌｅｖｅｌ.
族指数为 ９５.４０ꎮ ＰｔＣＨＩ 蛋白中带负电荷残基占氨
图 １ 葛根素和总黄酮的含量
基酸总数的 １２.０５％ꎬ而带正电荷残基为９.８２％ꎬ推
Ｆｉｇ. １ Ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｐｕｅｒａｒｉｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ
测该蛋白带负电ꎮ 亚细胞定位预测结果显示ꎬ定
位在细胞质的可能性达 ６４.２８％ꎬ其次是叶绿体为
以粉葛品种‘桂葛 １ 号’的叶片 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ克隆
１４.２８％ꎬ而定位于细胞核、线粒体和高尔基体的几
到 ＰｔＣＨＩ 基因片段(图 ２)ꎮ 该 ｃＤＮＡ 核苷酸序列长
率为 ７.１４％ꎮ
７４２ ｂｐꎬ具有一个长 ６７２ ｂｐ 的完整开放阅读框ꎬ启动 ２.３.２ ＰｔＣＨＩ 二、三级结构预测 通过 ＳＯＰＭＡ 在线
子 ＡＴＧ 位于 ５５ ｂｐꎬ终止子 ＴＧＡ 位于 ７２６ ｂｐꎬ推导 工具对 ＰｔＣＨＩ 蛋白二级结构进行预测分析ꎬ结果显
编码 ２２３ 个氨基酸( 图 ３)ꎮ 经 ＮＣＢＩ 网站 ｂｌａｓｔ 比 示该蛋白二级结构的形式及所占比例分别是 α￣螺
对ꎬ所克隆的片段与野葛的 ＣＨＩ 基因编码的蛋白具 旋最高(４８.６６％)ꎻ其次是无规则卷曲和延伸链这两
有 ９９％的同源性ꎮ ＣＨＩ 基因表达量结果显示ꎬＣＨＩ 种二级结构(分别为 ２４.１１％、１７.４１％)ꎬ而 β￣转角占
基因在野葛品种‘桂葛 ８ 号’中的表达量为根>茎> 比最低(９.８２％) (图 ５)ꎮ 通过 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 在线
叶ꎬ而在粉葛品种‘桂葛 １ 号’中的则为茎>根>叶ꎻ 工具预测 ＰｔＣＨＩ 蛋白三级结构发现ꎬ该蛋白的结构
除叶片外ꎬ野葛品种‘桂葛 ８ 号’中 ＣＨＩ 基因的表达 也包括 α￣螺旋、延伸链、β￣转角和无规则卷曲ꎬ其中
量均显著高于粉葛品种(图 ４)ꎮ 以 α￣螺旋居多ꎬ这与二级结构预测结果相符(图 ６)ꎮ
２.３ 粉葛 ＰｔＣＨＩ 蛋白生物信息学分析 ２.３.３ ＰｔＣＨＩ 磷酸化位点预测 通过 ＮｅｔＰｈｏｓ ３.１
２.３.１ ＰｔＣＨＩ 蛋白理化性质及亚细胞定位预测 理 Ｓｅｒｖｅｒ 在线预测 ＰｔＣＨＩ 磷酸化位点ꎬ结果显示该蛋
化性质预测结果表明ꎬＰｔＣＨＩ 蛋白由 ２２４ 个氨基酸 白主要存在 ２５ 个磷酸化位点ꎬ其中发生磷酸化可
组成ꎬ相对分子质量为 ２７.８ ｋＤꎬ理论等电点( ｐＩ) 能性最大的是位于 １０６ 位和 １６７ 位的丝氨酸ꎬ 得