Page 126 - 《广西植物》2023年第2期
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３ ２ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
图 ５ ＰｔＣＨＩ 蛋白的二级结构预测
Ｆｉｇ. ５ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰｔＣＨＩ ｐｒｏｔｅｉｎ
ＢＬ２１ 感受态细胞ꎬ经 ＰＣＲ 再次验证ꎬ证明目的基因
已成功连接至载体( 图 １０:Ｃ)ꎮ 这说明获得了含
ｐｅｔ２８ａ￣ＰｔＣＨＩ 重组质粒的原核表达菌株ꎮ
２.４.２ 重组蛋白诱导表达 将含有 ｐｅｔ２８ａ￣ＰｔＣＨＩ 重
组质粒的菌株ꎬ在 ０.５ ｍｍｏｌＬ ＩＰＴＧ 条件下置于
￣１
１６ ℃ 和 ３０ ℃ 环境中培养ꎬ在 ３０ ｋＤ 处有特异蛋白
条带出现ꎬ与目的蛋白大小相符ꎬ而无 ＩＰＴＧ 诱导
时无此特异性蛋白条带ꎬ表明 ｐｅｔ２８ａ￣ＰｔＣＨＩ 蛋白
在 ＢＬ２１ 表达菌株中被成功诱导表达ꎮ 其中ꎬＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ 检测结果表明ꎬ高温诱导下上清液中存在较
少的可溶性蛋白ꎬ表明低温能够促进该蛋白的可
溶性表达(图 １１)ꎮ
２.４.３ 重组蛋白的纯化及浓度测定 由于镍离子能
够与蛋白组氨酸中的咪唑环结合ꎬ因此利用镍离子
图 ６ ＰｔＣＨＩ 蛋白的三级结构预测 金属螯合亲和层析介质(Ｎｉ￣ＮＴＡ) 能够吸附含组氨
Ｆｉｇ. ６ Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰｔＣＨＩ ｐｒｏｔｅｉｎ 酸的蛋白质ꎮ 通过增加流动相咪唑的浓度ꎬ可将蛋
白进行替换洗脱ꎬ从而达到分离纯化蛋白的目的ꎮ
ＤＦＲ２( 与 花 色 苷 积 累 相 关) 互 作ꎬ 互 作 分 数 为 由图 １２ 可知ꎬ采用镍亲和层析法能够对 ＰｔＣＨＩ 重组
０.９７４ꎻ还与 ＳＦ３’Ｈ１(属于细胞色素 Ｐ４５０ 家族ꎬ与 蛋白进行有效的分离纯化ꎮ 当咪唑浓度(２０ ~ １００
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花青素积累相关)及查尔酮合成酶 ｃｈｓ８( 属于查尔 ｍｍｏｌ Ｌ ) 较 低 时ꎬ 杂 蛋 白 被 去 除ꎬ 浓 度 在 １２０
￣１
酮 / 二苯乙烯合成酶家族ꎬ与植物查尔酮类化合物 ｍｍｏｌＬ 以上时目的蛋白被替换洗脱ꎮ 当咪唑浓
￣１
积累、花色素形成及植物防御相关) 发生互作ꎬ互 度提高至 １６０ ｍｍｏｌＬ 时ꎬ蛋白条带较为单一ꎬ表
作分数分别为 ０.９５６、０.９５２(图 ９)ꎮ 明此时蛋白纯度较高ꎮ 将纯度高的蛋白进行 ｂｕｆｆｅｒ
￣１
２.４ 原核表达分析 置换ꎬ测得其 ＰｔＣＨＩ 蛋白浓度为 ６.３９ μｇμＬ ꎮ
２.４.１ 原核表达载体构建 由图 １０:Ａ 可知ꎬ在表 １ ２.４.４ 纯化蛋白的 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 验证 由于 ｐｅｔ２８ａ
特异引物下ꎬ经 ＰＣＲ 扩增后ꎬ分别获得约 ６６９ ｂｐ 的 载体质粒上带有组氨酸标签ꎬ因此可以用 Ｈｉｓ 抗体
产物ꎬ与目的基因大小相符ꎮ 将扩增产物与线性化 对纯化蛋白进行 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 验证ꎮ 由图 １３ 可知ꎬ
的 ｐｅｔ２８ａ 载体进行重组反应ꎬ并转化至 ＤＨ５αꎮ 提 经曝光后ꎬＰｔＣＨＩ 在 ＰＶＤＦ 膜上约 ２７.８ ｋＤ 处有目
取质粒ꎬ分别用限制性内切酶 ＸｈｏⅠ、ＳｐｅⅠ酶切ꎬ结 的蛋白条带出现ꎮ 对不同蛋白上样量均检测到特
果如图 １０:Ｂ 所示ꎬ分别在大小约５ ３００ ｂｐ和 ６６９ ｂｐ 异的蛋 白 条 带ꎬ 进 一 步 证 实 分 离 纯 化 的 蛋 白 为
处各有一 明 亮 条 带ꎮ 将 测 序 正 确 的 质 粒 转 化 至 ＰｔＣＨＩ 蛋白ꎮ
