Page 144 - 《广西植物》2023年第2期

３ ３ ８ 广 西 植 物 ４３ 卷
胁迫下的表达模式ꎮ 本研究旨在探讨以下问题: 整齐地摆放在水培盘中ꎬ待 ２ 片子叶展开后开始浇
(１)ＲｃＭｓｃ２ 蛋白理化性质、结构及物种间的进化 灌 １ / ４ Ｈｏａｇｌａｎｄ 溶液ꎬ每日补充 ２００ ｍＬꎮ 当幼苗长
关系ꎻ(２) 蓖麻 ＲｃＭｓｃ２ 基因的组织表达模式及非 至 ４ 叶龄时ꎬ剪取幼苗的组织(根、茎、子叶和真叶)
生物胁迫下的表达模式ꎻ(３) 蓖麻 ＲｃＭｓｃ２ 在冷胁 以检测 ＲｃＭｓｃ２ 基因的组织表达量ꎻ然后分别对其进
迫过程中的潜在功能ꎮ 本研究可为蓖麻的抗低温 行 ４ ℃、１５０ ｍｍｏｌＬ ＮａＣｌ、１０％ ＰＥＧ ６０００ 和 １００
￣１
育种提供潜在的基因资源ꎬ同时也可为解析蓖麻 μｍｏｌＬ ＡＢＡ 胁迫ꎬ经时间梯度(０、２、４、８、１２、２４、
￣１
ＲｃＭｓｃ２ 基因在应对冷胁迫方面的调控机制奠定 ３０、４８ ｈ) 处理后采集幼苗的真叶并迅速存于液氮
基础ꎮ 中ꎬ冷冻 ２４ ｈ 后转移至－７０ ℃冰箱备用ꎮ
１.３ ＲｃＭｓｃ２ 基因的克隆
１ 材料与方法 １.３.１ 总 ＲＮＡ 提取和第一链 ｃＤＮＡ 的合成 参照

ＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ 试剂盒的说明书操作步骤ꎬ提取
Ｍｏｎｚｏｌ
１.１ 试验材料 ４ ℃ 处理 １２ ｈ 的蓖麻组织的总 ＲＮＡꎬ并检测纯度ꎮ
ＴＭ
‘通篦 ５ 号’ 由通辽市农牧科学研究所提供ꎮ 以提取的 ＲＮＡ 作为模板ꎬ参照 ＭｏｎＳｃｒｉｐｔ ＲＴＩＩＩ
ＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ)、反转 Ａｌｌ￣ｉｎ￣Ｏｎｅ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｄｓＤＮａｓ 试剂盒说明书反转录合
植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒( Ｍｏｎｚｏｌ
ＴＭ
录试 剂 盒 ( ＭｏｎＳｃｒｉｐｔ ＲＴＩＩＩ Ａｌｌ￣ｉｎ￣Ｏｎｅ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ 成第一链 ｃＤＮＡꎬ作为克隆 ＲｃＭｓｃ２ 基因的模板ꎮ
ＴＭ １.３.２ ＲｃＭｓｃ２ 基因的克隆及测序 根据 ＮＣＢＩ 数据
ｄｓＤＮａｓ) 购自莫纳生物公司ꎮ Ｔ￣载体 ( ｐＭＤ １８￣Ｔ
ｖｅｃｔｏｒ)、限制性内切酶(Ｂｓａ Ｉ) 和 ＤＮＡ 连接试剂盒 库公布的 ＲｃＭｓｃ２ 基因( ＸＰ ＿００２５２１７０４.１) 的 ＣＤＳ
(ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ) 购自宝日医生物公司ꎮ 高保真 区设计引物 ＲｃＭｓｃ２￣Ｆ ｜ ＲｃＭｓｃ２￣Ｒ( 表 １)ꎮ 以蓖麻
ＰＣＲ 酶(ＫＯＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ)、ＰＣＲ 产物回收和纯化试 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ使用高保真酶( ＫＯＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ) 扩
剂盒购自天根生化科技有限公司ꎮ Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ 增 ＲｃＭｓｃ２ 基因的 ＣＤＳ 序列ꎬＰＣＲ 扩增反应程序:
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ 和 ２Ｘ ＳＧ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 购自赛 ９４ ℃ 预变性 ４ ｍｉｎꎻ ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ ５８ ℃ 退火 ４５
默飞世 尔 科 技 ( 上 海) 公 司ꎮ 大 肠 杆 菌 感 受 态 ｓꎬ ７２ ℃ 延伸 ９０ ｓꎬ ３５ 个循环ꎻ 最后延伸 １０ ｍｉｎꎮ
(ＤＨ５α)、保真酶(２×Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ)、引物合成和 经电泳检测后将符合大小的片段回收ꎬ在 ３′端加
测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成ꎮ Ａ 碱基后利用 ＤＮＡ 纯化试剂盒纯化产物后连接至
１.２ 材料处理 Ｔ 载体ꎬ将 ｐＭＤ １８￣Ｔ￣ＲｃＭｓｃ２ 热击转化 ＤＨ５αꎬ在
ＴＭ
将健康的蓖麻种子消毒后置入适量的无菌水 Ｋａｎ 培养基上筛选出阳性克隆送至生工生物工程
＋
中ꎬ于 ３０ ℃催芽 ３ ｄꎮ 出芽后将其平均分成 ４ 份ꎬ并 (上海)股份有限公司测序ꎮ

表 １ 本研究所用引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物名称 引物序列(５′￣３′) 用途
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′) Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ＲｃＭｓｃ２￣Ｆ ＴＴＧＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＴＧ 基因克隆
Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ
ＲｃＭｓｃ２￣Ｒ ＣＡＡＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＡ
ＲｃＭｓｃ２￣Ｆｘ ＣＧＡＧＣＡＣＴＡＡＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡ 实时荧光定量分析
ＲｃＭｓｃ２￣Ｒｘ ＣＣＡＴＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣＡＡＴＡＧＧＣＴＣ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
Ａｃｔｉｎ￣Ｆ ＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＧ
Ａｃｔｉｎ￣Ｒ ＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧ
ＲｃＭｓｃ２￣ＧＦＰ￣Ｆｘ ＣＡＧＴＧＧＴＣＴＣＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＴＧＴＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡ 亚细胞定位
Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
ＲｃＭｓｃ２￣ＧＦＰ￣Ｒｘ ＣＡＧＴＧＧＴＣＴＣＡＴＡＣＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＣＴＣＴＡＡＴＡＧＡＡ
注: 下划线是 Ｂｓａ Ｉ 酶切位点ꎬ左侧是保护碱基ꎬ右侧是荧光表达载体的末端同源序列ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｂｏｔｔｏｍ ｌｉｎｅ ｉｓ ｔｈｅ Ｂｓａ Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅꎬ ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｂａｓｅꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｉｓ ｔｈｅ ｅｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ.

１.４ ＲｃＭｓｃ２ 蛋白质的生物信息学分析 白序列ꎮ 在 ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ)下
借 助 ＥｘＰＡＳｙ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / 载蓖麻的全基因组、蛋白组和注释文件ꎬ将 ＲｃＭｓｃ２
ｔｒａｎｓｌａｔｅ / )工具将 ＲｃＭｓｃ２ 基因的编码序列翻译成蛋 蛋白作为靶序列进行本地 ＢＬＡＳＴｐꎬ以明确 ＲｃＭｓｃ２