Page 145 - 《广西植物》2023年第2期

２ 期 耿柳婷等: 蓖麻 ＲｃＭｓｃ２ 基因功能分析 ３ ３ ９

基因 的 具 体 位 置ꎮ 使 用 蛋 白 分 析 网 站 ＥｘＰＡＳｙ￣ 再将产物转化至 ＤＨ５α 感受态细胞ꎬ最后筛选出
ＰＲＯＳＩＴＥ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｐｒｏｓｉｔｅ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ) 分 析 ＲｃＭｓｃ２ 阳性克隆并送至生工生物工程(上海) 股份有限公
蛋白质的理化性质和亲水/ 疏水性ꎮ 借助 ＮＣＢＩ￣ＣＤ￣ 司 测 序ꎮ 确 认 测 序 结 果 正 确 后 将 ｐＫＹ￣３５Ｓ￣
ＳＥＡＲＣＨ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ＲｃＭｓｃ２￣ＧＦＰ 载体转至农杆菌中ꎬ最终在烟草叶片
ｂｗｒｐｓｂ / ｂｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)、 ＰＳＯＲＴ ( ｈｔｔｐ:/ / ｐｓｏｒｔ. ｈｇｃ. ｊｐ / ) 的表皮细胞中瞬时表达以确定 ＲｃＭｓｃ２ 基因的亚细
和 Ｍｏｔｉｆ Ｓｃａｎ(ｈｔｔｐｓ:/ / ｍｙｈｉｔｓ.ｓｉｂ.ｓｗｉｓｓ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｍｏｔｉｆ＿ 胞位置ꎮ
ｓｃａｎ / )工具分别预测蛋白的结构域、亚细胞位置和
２ 结果与分析
生物活性位点ꎮ 使用在线工具 ＳｉｇｎａｌＰ ５.０(ｈｔｔｐｓ:/ /
ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ? ＳｉｇｎａｌＰ￣５.０)、
２.１ ＲｃＭｓｃ２ 基因的克隆
ＤｅｅｐＴＭＨＭＭ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｄｔｕ. ｂｉｏｌｉｂ. ｃｏｍ/ ＤｅｅｐＴＭＨＭＭ)
根据前期转录组数据信息ꎬ提取蓖麻叶片总
和 Ｍｏｔｉｆ Ｓｃａｎ(ｈｔｔｐｓ:/ / ｍｙｈｉｔｓ.ｓｉｂ.ｓｗｉｓｓ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ ｍｏｔｉｆ＿
ｓｃａｎ)分别预测该蛋白的信号肽、跨膜域和生物活性 ＲＮＡꎬ质量符合反转录操作要求( 图 １:Ａ)ꎮ 并以
位 点ꎮ 利 用 ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ 数 据 库 ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｃＤＮＡ 为模板进行目的基因的扩增ꎬ得到大约１ ３００
ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ / ｈｅｌｐ / ｕｎｉｐｒｏｔｋｂ) 在线 ＢＬＡＳＴｐ 程序下载 ｂｐ 的条带(图 １:Ｂ)ꎬ并经过 Ｔ￣Ａ 克隆、转化、阳性菌
落的克隆和测序ꎬ得到 １ ２９９ ｂｐ 的 ＯＲＦꎬ推导其编
ＲｃＭｓｃ２ 蛋白质的同源序列ꎬ使用 ＣｌｕｓｔａｌＷ 和 ＭＥＧＡ
１１.０ 软件对下载的序列进行比对及可视化分析ꎬ将 码为 ４３２ 个 ａａ ( 图 ２)ꎬ 并 命 名 为 ＲｃＭｓｃ２ꎬ 本 地
ＢＬＡＳＴｐ 检索发现其定位在第 ５ 号染色体长臂ꎮ
多序列比对结果提交至 ＥＮＤｓｃｒｉｐｔ/ ＥＳＰｒｉｐｔ(ｈｔｔｐｓ:/ /
ｅｓｐｒｉｐｔ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ ＥＳＰｒｉｐｔ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ ＥＳＰｒｉｐｔ.ｃｇｉ) 网站进行

美化并将进化树提交至 ｉＴＯＬ(ｈｔｔｐｓ:/ / ｉｔｏｌ.ｅｍｂｌ.ｄｅ)
网 站 进 行 美 化ꎮ 蛋 白 质 的 二 级 结 构 在 ＳＯＰＭＡ
(ｈｔｔｐｓ:/ / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｓｏｐｍａ.ｐｌ)
进行可视化预测ꎮ 将 ＲｃＭｓｃ２ 蛋白质提交至 ＳＷＩＳＳ￣
ＭＯＤＬＥ(ｈｔｔｐｓ:/ / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ )预测其三级
结构并借助 ＳＡＶＥＳ ｖ６.０(ｈｔｔｐｓ:/ / ｓａｖｅｓ.ｍｂｉ.ｕｃｌａ.ｅｄｕ/ )
工具对预测模型打分ꎬ检测合格后对其蛋白质的三 Ａ. 蓖 麻 总 ＲＮＡ 的 提 取ꎻ Ｂ. ＲｃＭｓｃ２ 基 因 ＣＤＳ 区 扩 增ꎮ
１. ＰＣＲ 产物ꎻ ２. ＤＬ ２ ０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎮ
级结构进行分析ꎮ Ａ. Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓꎻ Ｂ.
１.５ ＲｃＭｓｃ２ 基因的表达分析 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤＳ ｒｅｇｉｏｎ ｆｒｏｍ ＲｃＭｓｃ２ ｇｅｎｅ. １. ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎻ ２. ＤＬ ２ ０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ.
根据 ＲｃＭｓｃ２ 基因的 ＣＤＳ 序列设计 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引
图 １ 总 ＲＮＡ 的提取和 ＲｃＭｓｃ２ 基因的扩增
物 ＲｃＭｓｃ２￣Ｆｘ ｜ ＲｃＭｓｃ２￣Ｒｘ( 表 １)ꎬ以 ＲｃＡｃｔｉｎ ( ＮＣ ＿
Ｆｉｇ. １ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ＲｃＭｓｃ２
０６３２６２.１)基因作为内参基因ꎬ分析 ＲｃＭｓｃ２ 基因的
ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
组织表达模式及胁迫处理下的表达模式ꎮ 以 Ｔｒｉｚｏｌ
法提取蓖麻组织的总 ＲＮＡꎬ并反转录成单链 ｃＤＮＡ ２.２ ＲｃＭｓｃ２ 蛋白的生物信息学分析
作为 ＰＣＲ 扩增的模板ꎬ严格按照 ２Ｘ ＳＧ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ ２. ２. １ ＲｃＭｓｃ２ 蛋 白 的 基 本 理 化 性 质 分 析
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 的说明书操作步骤ꎬ在 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ⅱ Ｐｒｏｔｐａｒａｍ 工具预测结果显示ꎬＲｃＭｓｃ２ 蛋白的分子
型 ＰＣＲ 仪上完成对基因的扩增ꎮ 反应程序:预变性 Ｓ ꎬ共计 ６ ８８６ 个原子ꎬ相对
式为 Ｃ
２１８６ Ｈ ３４２６ Ｎ ５８４ Ｏ ６６２ ２８
９５ ℃ ３ｍｉｎꎬ变性 ９５ ℃ ５ ｓꎬ退火和延伸 ６０ ℃ ３０ ｓꎬ 分子质量为 ４９.３８ ｋＤꎬ理论等电点为 ５.２６ꎬ说明
－(ΔΔＣｔ) 法计算 ＲｃＭｓｃ２ 基因的相对表
４５ 个循环ꎮ 用 ２ ＲｃＭｓｃ２ 蛋白呈酸性ꎻ该蛋白由 ２０ 种氨基酸组成ꎬ
达量ꎮ 其中谷氨酸(Ｇｌｕ)数量最庞大ꎬ占总数的 ９％ꎬ而色
１.６ ＲｃＭｓｃ２ 蛋白质亚细胞定位 氨酸(Ｔｒｐ)数量最少ꎬ仅占总数的 ０.７％ꎬ带负电荷

使用限制性酶 Ｂｓａ Ｉ 对 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００￣ＣａＭＶ 的氨基酸(Ａｓｐ ＋ Ｇｌｕ)有 ６０ 个ꎬ带正电荷的氨基酸
ＴＭ
３５Ｓ￣ＧＦＰ 进行酶切后回收目的片段ꎮ 将 ｐＭＤ １８￣ (Ａｒｇ ＋ Ｌｙｓ) 有 ４６ 个( 图 ２)ꎻ不稳定系数为 ４５.２４
Ｔ￣ＲｃＭｓｃ２ 作 为 重 组 ＤＮＡ 的 模 板ꎬ 扩 增 引 物 为 ( >４０ 阈值)ꎬ表明该蛋白是不稳定蛋白ꎻ总平均疏

ＲｃＭｓｃ２￣ＧＦＰ￣Ｆｘ ｜ ＲｃＭｓｃ２￣ＧＦＰ￣Ｒｘꎮ 使 用 ＫＯＤ Ｍａｓｔｅｒ 水性为－０.３５３( <０)ꎬ预测该蛋白是亲水蛋白ꎻ蛋白
Ｍｉｘ 先将模板序列连接在 ｐＫＹ￣３５Ｓ￣ＧＦＰ 载体上ꎬ 的脂肪指数为 ８１.６９ꎮ 另外ꎬＲｃＭｓｃ２ 蛋白拥有一