Page 167 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 杨兰锋等: 苦荞 ＴＣＰ 转录因子全基因组鉴定及非生物胁迫分析 １ ３ ６ ７

迅速磨成粉末ꎬ使用 ＲＮＡ 试剂盒提取苦荞叶片总 表 １ 引物序列汇总
ＲＮＡꎬ使用 １％琼脂糖凝胶电泳检验其质量ꎬ使用 Ｔａｂｌｅ １ Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
超微量核酸仪测定其浓度ꎬ使用反转录试剂盒将 引物名称 引物序列 (５′￣３′) 用途
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) Ｐｕｒｐｏｓｅ
苦 荞 ＲＮＡ 反 转 录 合 成 ｃＤＮＡꎬ 浓 度 稀 释 至 １００
￣１ ＦｔＨ３￣ＱＦ ＧＡＡＡＴＴＣＧＣＡＡＧＴＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧ 实时荧光
ｎｇμＬ ꎬ－４ ℃ 保存备用ꎮ
定量 ＰＣＲ
使用 Ｐｒｉｍｅｒ ５. ０ 设 计 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 特 异 性 引 物 内参基因
(表 １)ꎬＦｔＨ３(ＨＭ６２８９０３)为内参基因ꎮ ＰＣＲ 体系 ＦｔＨ３￣ＱＲ ＣＣＡＡＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＣＴＣＡＧＣ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｇｅｎｅ ｏｆ
ｑＲＴ￣ＰＣＲ
为 ２× ｍｉｘ １０ μＬ、上下游引物各 ０.８ μＬ、ｃＤＮＡ １
ＦｔＴＣＰ６￣ＱＦ ＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＧＧ 实时荧光定量
μＬ、ｄｄＨ Ｏ ７.４ μＬꎮ 扩增程序:９５ ℃ １ ｍｉｎꎻ９５ ℃ ＰＣＲ
２
ＦｔＴＣＰ６￣ＱＲ ＧＡＡＣＣＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴＣＣＧＴ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
１０ ｓꎬ６０ ℃ ３０ ｓꎬ１ 个循环ꎻ９５ ℃ １０ ｓꎬ６０ ℃ ３０ ｓꎬ
ＦｔＴＣＰ３￣ＱＦ ＣＴＡＧＧＧＡＧＣＴＣＧＧＡＣＡＣＡＡＧ
９５ ℃ ３０ ｓꎬ４０ 个循环ꎮ 每个样品设置 ４ 个生物学
ＦｔＴＣＰ３￣ＱＲ ＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＴＴＴ
－ΔΔＣｔ
重复ꎬ用 ２ 法计算基因相对表达量ꎮ
ＦｔＴＣＰ１２￣ＱＦ ＧＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＣ
２ 结果与分析 ＦｔＴＣＰ１２￣ＱＲ ＧＧＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＴＡＧＡＣＡＧＴＴ
ＦｔＴＣＰ１３￣ＱＦ ＴＡＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣ
２.１ ＦｔＴＣＰ 基因家族的鉴定和分析 ＦｔＴＣＰ１３￣ＱＲ ＣＣＴＧＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＡ
基于保守结构域ꎬ从苦荞的全基因组中鉴定
出 ２８ 个苦荞 ＴＣＰ 家族成员ꎬ根据其蛋白分子量大
小依次命名为 ＦｔＴＣＰ１－ＦｔＴＣＰ２８ꎮ 由表 ２ 可知ꎬ苦 中有 ５ 个成员ꎬⅡ组中有 ６ 个成员ꎬⅢ组中有 １２ 个
荞 ＴＣＰ 基因家族理化性质差异较大ꎬ氨基酸长度 成员ꎬⅣ中有 ５ 个成员ꎮ 相邻分支的苦荞 ＴＣＰ 基
因具有相似的基因结构ꎻ保守结构域分析结果显
在 ８４ ~ ４７５ ａａ 之间ꎻ分子量(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔꎬＭＷ)
在 ９.５０ ~ ５１.０４ ｋＤ 之间ꎻ等电点( ｐＩ) 介于 ４.９３ ~ 示ꎬ２８ 个苦荞 ＴＣＰ 蛋白共有 １０ 个 ｍｏｔｉｆ( 图 ２:Ｂ)ꎬ
９.７１ 之间ꎻ酸性蛋白和碱性蛋白分布均匀ꎻ脂肪指 ＦｔＴＣＰ８、 ＦｔＴＣＰ９、 ＦｔＴＣＰ６、 ＦｔＴＣＰ１２、 ＦｔＴＣＰ１１、
数为 ５３. ２９ ~ ９７. ５０ꎻ 亚 细 胞 定 位 预 测 显 示ꎬ 除 ＦｔＴＣＰ４、ＦｔＴＣＰ１ 不含 Ｍｏｔｉｆ １ꎻＭｏｔｉｆ ４ 位于 Ｎ 端附
ＦｔＴＣＰ１ 和 ＦｔＴＣＰ２ 定位在细胞质中外ꎬ其余 ２６ 个 近ꎮ 大部分苦荞 ＴＣＰ 蛋白含有 ２ ~ ３ 个保守基序ꎬ
ＦｔＴＣＰ１ 上只有 １ 个保守基序ꎬＦｔＴＣＰ７ 上含有 ４ 个
均定 位 于 细 胞 核 中ꎮ 不 稳 定 指 数 介 于 ３４. ８８ ~
保守基序ꎬＦｔＴＣＰ２６ 和 ＦｔＴＣＰ２８ 上含有 ６ 个保守
７１.１２ 之间ꎮ
２.２ ＦｔＴＣＰ 基因家族系统发育分析 基序ꎻ所 有 苦 荞 ＴＣＰ 基 因 都 只 包 含 １ 个 典 型 的
为了全面分析苦荞 ＴＣＰ 基因家族的功能ꎬ首 ＴＣＰ 结构域( 图 ２:Ｃ)ꎻ基因结构分析显示( 图 ２:
先对其进化关系进行分析ꎮ 选取苦荞、水稻、拟南 Ｄ)ꎬ１１ 个苦荞 ＴＣＰ 基因包含内含子ꎬⅢ组中内含
芥、甜菜和甜荞 ５ 个物种共 １２１ 条 ＴＣＰ 蛋白序列 子数量最多ꎬ推测该亚族在进化过程中发生了内
构建系统发育树( 图 １)ꎮ 结果显示ꎬ苦荞 ＴＣＰ 基 含子的插入ꎮ 内含子长度存在较大差异ꎬ导致这
因家族被划分为 ５ 个亚家族( Ａ１－Ａ５)ꎬ分别含有 些基因的长度差距较大ꎮ ＦｔＴＣＰ２８ 基因的长度最
２０ 个、３９ 个、２１ 个、１７ 个、２４ 个成员ꎮ 苦荞 ＴＣＰ 长ꎬ它的长度约占基因总长度的 ５０％ꎮ
基因在 Ａ２ 中分布最多ꎬ有 ９ 个成员ꎻ在 Ａ３ 亚族中 ２.４ ＦｔＴＣＰ 基因家族启动子顺式作用元件分析
分布最少ꎬ只有 ２ 个成员ꎮ 甜荞和苦荞同属荞麦 顺式作用元件分析( 图 ３) 显示ꎬ苦荞 ＴＣＰ 基
属ꎬ亲缘关系最近ꎬ在进化树末端有 ２０ 对苦荞和 因启动子区主要包含胁迫响应元件和激素响应元
甜荞 ＴＣＰ 蛋白两两相聚ꎻ苦荞与水稻进化关系较 件ꎬ其中激素响应元件种类多且分布广泛ꎬ推测苦
远ꎬ这与单子叶和双子叶植物进化关系一致ꎮ 在 荞 ＴＣＰ 基因在激素调节中发挥重要作用ꎮ 在 ３９

同一亚族内ꎬ种内的 ＴＣＰ 蛋白更容易聚集在一起ꎮ 个响应 元 件 中ꎬ 光 照 响 应 元 件 有 ２４ 个ꎬ 占 比 约
２.３ ＦｔＴＣＰ 基因结构和蛋白保守基序分析 ６１.５３％ꎬ说明苦荞 ＴＣＰ 基因的转录可能受光周期
利用 ２８ 个苦荞 ＴＣＰ 蛋白序列构建系统发育 调控ꎮ 脱落酸 ＡＢＲＥ 响应元件在苦荞 ２６ 个 ＦｔＴＣＰ
树(图 ２:Ａ)ꎬ苦荞 ＴＣＰ 蛋白被分为 ４ 组ꎬ其中Ⅰ组 基因中都有分布ꎬ在 ＦｔＴＣＰ１２ 中响应程度最高ꎮ