Page 26 - 《广西植物》2020年第1期

２ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷
制ꎮ 本研究在对假阳性产物进行测序分析时发
现ꎬ污染物的来源与人体密切相关ꎬ其他来源的污
染相对较少ꎬ说明对环境、试剂、耗材等的污染较
易防 控ꎮ 但 是ꎬ 人 体 无 法 使 用 常 规 方 式 对 外 源
ＤＮＡ 进行降解和破坏ꎮ 因此ꎬ在实验过程中ꎬ要严
格避免人体任何部位与实验试剂、耗材甚至操作
环境的直接接触ꎬ要全程穿戴一次性鞋套、口罩、
帽子、实验服等ꎬ最大限度的减少外源污染ꎮ (二)
单染色体扩增失败可能并不是因为模板量太小ꎬ
而是由于染色体本身没有得到有效扩增ꎮ 本研究
中ꎬ使用一个完整细胞的全部 ４２ 条染色体进行扩
Ｐ. 阳性对照(小麦基因组酶切产物)ꎻ ３. 图 ４ 中 ３ 号(一个 增ꎬ同样没有获得目标样本的基因组扩增信息ꎬ而
完整小麦细胞的全部 ４２ 条染色体) 扩增产物ꎻ ５. 图 ４ 中 ５ 小麦基因组大小为 １５.４ ~ １５.８ Ｇｂ( Ａｐｐｅｌｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ
号(单条小麦染色体)扩增产物ꎻ Ｎ. 假阳性扩增产物ꎮ
２０１８)ꎬ却大于已经成功进行单细胞测序的绝大多
Ｐ. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ (ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ)ꎻ ３. Ｔｈｅ ｓａｍｅ
数物种ꎮ 因此ꎬ推测本实验使用单细胞技术进行
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｓ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｓａｍｐｌｅ Ｎｏ. ３ ｉｎ Ｆｉｇ. ４ (ｔｈｅ
ｗｈｏｌｅ ４２ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ａ ｗｈｅａｔ ｃｅｌｌ)ꎻ ５. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ 小麦单染色体扩增失败的主要原因可能在于染色
ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｓ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｓａｍｐｌｅ Ｎｏ. ５ ｉｎ Ｆｉｇ. ４ (ａ ｓｉｎｇｌｅ ｗｈｅａｔ ｃｈｒｏ￣
体的形态ꎮ 染色体的高度浓缩超螺旋状态会影响
ｍｏｓｏｍｅ)ꎻ Ｎ. Ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ.
组蛋白的去除及 ＤＮＡ 变性ꎬ一般的裂解条件可能
图 ５ 染色体 ＭＤＡ 扩增产物的 ｓｏｕｔｈｅｒｎ 印记杂交
无法使 ＤＮＡ 从这种超螺旋状态转变为线性且可以
Ｆｉｇ. ５ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ￣ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ
与引物有效结合的状态ꎬ无法有效启动复制ꎮ 此
ｗｈｅａｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＭＤＡ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
外ꎬ染色体制备过程中残留的固定剂、染色剂等成
分可能会对组蛋白消化和 ＤＮＡ 聚合酶反应等造成
表 ３ 染色体测序比对结果
影响ꎮ
Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｌａｓｔｅｄ ｔｏ ＮＴ ｄａｔａｂａｓｅ
为成功使用单细胞测序技术进行单条染色体
样品名称 比对第一物种 比对第二物种 的体外扩增ꎬ建议从以下几个方面进行尝试:(１)
Ｓａｍｐｌｅ Ｈｉｔ １ Ｈｉｔ ２
整个操作过程必须保证完全的无菌环境ꎬ所使用
Ｎｏ. ３ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｕｎｋｎｏｗｎ
的仪器、器皿等工具应严格高压灭菌和紫外线灭
Ｎｏ. ５ Ｈ. ｓａｐｉｅｎｓ Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ
菌ꎻ体外扩增试剂应选用经过严格无菌化处理的
ＭＤＡ０１ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ 商品化试剂盒ꎻ实验用水和其他试剂必须进行严
ｐｈａｇｅ Ｏｕｒｏｂｏｒｏｓ ｐｈａｇｅ Ｌａｕｃｈｅｌｌｙ
格的灭菌和质量检测ꎬ确保无外源 ＤＮＡ 污染后方
ＭＤＡ０２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ
可使用ꎻ严格做好自身防护ꎬ减少人体裸露部位暴
露在环境中的机会ꎻ全程设无菌水阴性对照ꎻ最好
骤涉及使用较多试剂、耗材和不同操作空间ꎬ绝对 使用新建实验室和新的超净工作台等进行操作ꎬ

控制外源污染困难较大ꎮ 其次ꎬ在使用 ＭＡＬＢＡＣ 且需将染色体分离和扩增两个环节在不同实验室
技术进行扩增时ꎬ在第二轮使用较多的循环数会 分开进行ꎬ避免气溶胶的污染ꎮ (２) 通过高盐缓冲
增加假阳性现象发生的几率ꎻ而使用 ＭＤＡ 技术进 液、使用蛋白酶 Ｋ 消化、延长消化时间等措施尽量

行扩 增 时ꎬ 阴 性 对 照 也 往 往 产 生 假 阳 性 现 象 ( 去除组蛋白ꎬ同时综合运用生物酶( 如拓扑异构酶
Ｍａｒｃｙ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７ꎻ Ｙｉｌｍａｚ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１０)ꎮ 两种单 等)、离心机械力等方法ꎬ尽可能地使染色体变为

细胞测序技术对模板的扩增均具有较高灵敏度ꎬ 松散的线性状态ꎮ (３) 评估染色体制备过程中不
假阳性的存在可能是因为极微量外源 ＤＮＡ 在目标 同药剂对后续实验的影响ꎬ选择最合适的染色体
样品缺乏时被扩增或引物自身形成的引物多聚体 制备和染色方法ꎬ并争取在前处理过程中通过减
现象ꎬ如果在目标样品存在并获得优先扩增的情 少操作时间、中和反应和溶剂冲洗等措施降低或
况下ꎬ外源污染的扩增或多聚物的形成则会被抑 去除这种影响ꎮ 建议使用较温和的方法获得染色