Page 81 - 《广西植物》2020年第1期

１ 期 李依容等: 基于叶绿体基因证据的民族药滇白珠复合群系统发育关系 ７ ７

续表 １
居群编号 采集号 个体数 海拔
变种名称 采集地 纬度 经度
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ａｌｔｉｔｕｄｅ
Ｎａｍｅ ｏｆ ｖａｒｉｅｔｙ Ｓａｍｐｌｉｎｇ ｌｏｃａｔｉｏｎ Ｌａｔｉｔｕｄｅ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
ｃｏｄｅ ｎｕｍｂｅｒ ｓａｍｐｌｅｓ (ｍ)
ＹＨＡ 中国贵州印江 ＬＬ￣２０１７－０７ ３ ２７°５７′ Ｎ １０８°３６′ Ｅ ８１５
Ｙｉｎｊｉａｎｇꎬ Ｇｕｉｚｈｏｕꎬ Ｃｈｉｎａ
秃果白珠 ＨＸＱ 中国台湾玉山 ＨＸＱ￣１００１ ３ ２３°２７′ Ｎ １２０°５４′ Ｅ １ ７７４
Ｇ. ｌｅｕｃｏｃａｒｐａ Ｙｕｓｈａｎꎬ Ｔａｉｗａｎꎬ Ｃｈｉｎａ
ｖａｒ. ｐｓｉｌｏｃａｒｐａ
Ｆ 菲律宾南达沃棉兰老岛 Ｐｅｎｎｅｙｓ ２３５５ ３ ６°５９′ Ｎ １２５°１６′ Ｅ ２ ８２５
Ｍｉｎｄａｎａｏꎬ Ｄａｖａｏ ｄｅｌ Ｓｕｒꎬ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ
白果白珠原变种 ＷＨ 马来西亚鼓亨云顶高原 ＷＨ￣２０１１ ３ ３°２５′ Ｎ １０１°４７′ Ｅ １ ７４８
Ｇ. ｌｅｕｃｏｃａｒｐａ Ｇｅｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈｌａｎｄｓꎬ Ｐａｈａｎｇꎬ Ｍａｌａｙｓｉａ
ｖａｒ. ｌｅｕｃｏｃａｒｐａ
芳香白珠(外类群) ＦＸ 中国云南大理苍山 ＬＬ￣２０１９－０４ ３ ２５°４８′ Ｎ １００°０６′ Ｅ ２ １７９
Ｇ. ｆｒａｇｒａｎｔｉｓｓｉｍａ Ｃａｎｇｓｈａｎꎬ Ｄａｌｉꎬ Ｙｕｎｎａｎꎬ Ｃｈｉｎａ
(ｏｕｔｇｒｏｕｐ)

计 ( ＮａｎｏＤｒｏｐ ® ＮＤ￣１０００ꎬ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ ａｌ.ꎬ ２００８)ꎮ 利 用 软 件 ｊｍｏｄｅｌｔｅｓｔ ２. １１０ ( Ｄａｒｒｉｂａꎬ
ＤｅｌａｗａｒｅꎬＵＳＡ)测定 ＤＮＡ 的浓度和纯度ꎬ用 ｄｄＨ Ｏ ２０１２)ꎬ分别检测到两个叶绿体基因片段的最佳碱
２
￣１ 基替代模型都为 ＧＴＲꎮ 最大似然法依据 ＤＮＡ 序列
稀释至 ３０ ~ ５０ ｎｇμＬ 以备后续 ＰＣＲ 扩增使用ꎮ
扩增体 系: １０ μＬ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ( ２ ×) ( Ｔｈｅｒｍｏ 突变是随机的这种假设ꎬ将构建系统树所用到的分
￣１ 枝长度与推断肯定发生的额外突变结合起来ꎬ利用
Ｓｃｉｅｎｔｉfiｃ)ꎬ９ μＬ ｄｄＨ Ｏꎬ正反向引物(１０ ｎｇμＬ )
２
各 ０.４ μＬꎬ１ μＬ 模板 ＤＮＡꎮ ＰＣＲ 扩增反应程序: 特定突变概率的所有假设共同组成一个演化模型
９４ ℃ 预 变 性 ４ ｍｉｎꎻ ９４ ℃ 变 性 ４５ ｓꎬ ５２ ℃ (ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ)ꎬ选取具有最大可能性的树作为
(ｔｒｎＬ￣ｒｐｌ３２) / ６０ ℃(ｒｐｌ３３￣ｐｓａＪ)退火 １ ｍｉｎꎬ７２ ℃ 延 引证ꎬ 分 析 其 系 统 进 化 关 系ꎬ 并 计 算 支 持 率
伸 ４５ ｓꎬ循环 ３５ 次ꎻ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎮ 取 ２ μＬ 扩 (ＢｏｏｔｓｔｒａｐꎬＢＰ)ꎮ 用贝叶斯法构建系统进化关系树
增产物进行 １.５％ 琼脂糖凝胶电泳ꎬ检测扩增产物 时ꎬ需对 ４ 个平行进化链进行１ ０００ 万代运算ꎬ每
的产量和质量ꎮ 剩余的 ＰＣＲ 扩增产物纯化后ꎬ采用 １０ ０００代保存一棵进化树ꎬ分别去掉最初和最后的
５.５ μＬ 的反应体积ꎬ包括 １. ５ μＬ 的测序混合物 ２５％系统进化树作为“ｂｕｒｎ￣ｉｎ”ꎮ 每个分支的支持率
(ＢｉｇＤｙｅ)、１ μＬ的测序引物、１ μＬ 的纯化 ＰＣＲ 产物 由保存的进化树中出现的后验概率(ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｐｒｏｂａ￣

和 ２ μＬ 的双蒸水ꎮ 反应程序:９５ ℃ 预变性 ４０ ｓꎻ ｂｉｌｉｔｙꎬＰＰ)表示ꎬ后验概率值 ＰＰ<０.９５ 视为低或较弱
９５ ℃ ２０ ｓ、５０ ℃ １０ ｓ、６０ ℃ １ ｍｉｎ ３０ ｓꎬ共 ３５ 个循 的支持ꎬ０.９５ ~ １.００ 视为高或好的支持ꎮ 两种建树
环进行测序反应ꎮ 反应产物经过 ７５％乙醇和无水 方法 都 通 过 ＣＩＰＲＥＳ 网 上 建 树 平 台 ( ｈｔｔｐｓ:/ /
乙醇纯化后ꎬ加入 １０ μＬ 的双蒸水充分溶解ꎬ用 ＡＢＩ ｗｗｗ.ｐｈｙｌｏ.ｏｒｇ / )实现ꎬ最后得到的基于 ＭＬ 和 ＢＩ 法
３７３０ ｘｌ 自 动 测 序 仪 ( Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓꎬ Ｆｏｓｔｅｒ 的严 格 一 致 树 用 Ｆｉｇｔｒｅｅ １. ４３ 软 件 ( ｈｔｔｐ:/ / ｔｒｅｅ.
ＣｉｔｙꎬＣａｌｉｆｏｒｎｉａꎬＵＳＡ)进行测序ꎮ ｂｉｏ.ｅｄ.ａｃ.ｕｋ / ｓｏｆｔｗａｒｅ / ｆｉｇｔｒｅｅ / )查看ꎮ 为了直观地判
１.４ 数据分析 断滇白珠复合群的系统演化关系ꎬ用 Ｓｐｌｉｔｓｔｒｅｅ４ 软
所得序列用 Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ 软件进行拼接ꎮ 拼接好 件运用邻接网法(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｎｅｔ) 构建系统发育网络
的序列首先逐一对每一个变异位点的原始峰图进行 (Ｂｒｙａｎｔꎬ２００３)ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐｐｉｎｇ 通过 １ ０００ 次重复ꎬ支
校对ꎬ确认无误后用 Ｓｅ￣ａｌ 软件进行比对构建矩阵ꎬ 持率大于 ５０％的显示在支上ꎮ
根据头尾的缺失情况对序列做适当调整ꎬ矩阵中的
插入/ 缺失(ｉｎｄｅｌ)处理为单次进化事件ꎮ 为解析目 ２ 结果与分析
前所获各居群间的系统进化关系ꎬ我们对两个叶绿
体片段 ｒｐｌ３３￣ｐｓａＪ 和 ｔｒｎＬ￣ｒｐｌ３２ 进行了联合分析ꎮ 本 ２.１ 从滇白珠复合群 ２４１ 个样本和外类群芳香白
研究用最大似然法(Ｍａｘｉｍｕｍ ＬｉｋｅｌｉｈｏｏｄꎬＭＬ) 和贝 珠 ３ 个样本获得 ｒｐｌ３３￣ｐｓａＪ 和 ｔｒｎＬ￣ｒｐｌ３２ 片段
叶斯法(Ｂａｙｅｓｉａｎ ＩｎｆｅｒｅｎｃｅꎬＢＩ) 构建系统树ꎬ以比较 ｒｐｌ３３￣ｐｓａＪ 片段比对矩阵长 ６７８ ｂｐꎬ共有 ２４１

不同拓扑结构的异同ꎬ并计算支持率(Ｓｔａｍａｔａｋｉｓ ｅｔ 条序列ꎬ一致位点( ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｉｔｅ) 有 ６６５ 个ꎬ变异