Page 133 - 《广西植物》2020年第12期

ϟ ऐ ϟ ऐ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ԡ 卷
测合格后用于后续 ዹ᧕શዶ 的合成ᤥ 取 Ꭾဂᓂ ኏શዶ औऔऔ঎ᔀ଴ᡱᑕ༁ᢃ঎ዹၤ ᣰ ᡷᆍᆍ᤟༁ᣰ ᡱʢᆍᡷᡱᑕʢᑕቝ঎ၤᡷቝ᤟ɯ 预测蛋白的分
使用 ఋ᧧ዶશ୩ዹʢᔽᡱᡷ ዹ᧕શዶ 第一链合成试剂盒Џ天根生 子量等理化性质ଫ使用在线软件 ୩ᔽႿᑕ᤟۪ ࿗঎ϟྉၤᡷᡷᡱ᧥ᣰ ᣰ
化科技ྉ北京ɯ 有限公司૒ 合成 ዹ᧕શዶᖔ具体操作方 औऔऔ঎ዹᤦ༁঎ʛᡷࣼ঎ʛҴ ᣰ ༁ᔀʢ׹ᔽዹᔀ༁ᣰ ୩ᔽ੫Ⴟᑕ᤟۪ ᣰ ɯ 预测分析蛋白信

法参照试剂盒说明书进行ᤥ 号肽ଫ 使用 ఋᥘᡱʢᔀʛ ྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ ᔀቝᤦႿᔀᡷ঎ ׹ᔽᡷᑕ᤟᥋ᔽᡷ঎ ዹၤ ᣰ
ϓॹᇺ 地黄 ࣷᦵۗᣞ 基因的克隆 ༁ᆍ஦ᡷऔᑕʢᔀ ᣰ ఋᥘ۪኏ጶ᧕ᡸ஦ᆍʢቝ঎ၤᡷቝ᤟ɯ预测蛋白跨膜区ଫ使用

以地黄组培苗转录组数 据库中一条注释为 શ۪୩ዶ ༁ᔀʢ׹ᔀʢྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ᣰ ᣰ Ⴟᡱ༁ᑕ᥋ᡱᤦᔽ᤟঎ ᔽᤦዹᡱ঎ ஦ʢᣰ ዹ੫ᔽ᥋ᤦᔽႿ ᣰ Ⴟᡱ༁ᑕᡸ
ࣷᦵۗᣞ 的 ࣼႿᔽ੫ᔀႿᔀ 全长序列为参 考 序 列ᖔ 使用 ᑕࣼᡷᆍቝᑕᡷ঎ᡱ᤟ᥳ ᡱᑕ੫ᔀ ᢉႿᡱ༁ᑕᡸ༁ᆍᡱቝ঎ၤᡷቝ᤟ɯ预测蛋白二级结
۪ʢᔽቝᔀʢ ۪ʢᔀቝᔽᔀʢ ጢ 设计特异 性 引 物ᖔ 具体见表 ϟᤥ 构ଫ使用 ۪୩ᨃ኏ఋྉၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ औऔऔ঎ᡱ༁ᆍʢᡷ঎ᆍʢ੫ ᣰ ɯ 预测蛋白
۪ऊ኏ 反应体系为 ԰ԡ ဂᓂᖔ 具体组分如下᧥ 模板 亚 细胞定位ଫ 使用 ୩ᥘዶ኏ఋ ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ᣰ ᣰ ༁ቝᑕʢᡷ঎ ᔀቝᤦ᤟᥋
ዹ᧕શዶ ԰঎ԡ ဂᓂܦ԰ ġ ጶ༁ ఋᑕी ቝᔽ଴ ϟԡ ဂᓂܦ上下游引物 ၤᔀᔽʛᔀ᤟ᤦᔀʢ੫঎ʛᔀ ᣰ ɯ 预测蛋白功能域ଫ使用 શᔀᡷ۪ၤᆍ༁ ሕ঎ϟ

ྉ኏੫ऊ᧕۪᣽᥋èᖔ኏੫ऊ᧕۪᣽᥋኏ɯ各 ϟ঎ԡ ဂᓂܦ其余用 ʛʛ̀ ᨃ ྉၤᡷᡷᡱ᧥ᣰ ᣰ औऔऔ঎ ዹᤦ༁঎ ʛᡷࣼ঎ ʛҴ ᣰ ༁ᔀʢ׹ᔽዹᔀ༁ᣰ શᔀᡷ۪ၤᆍ༁ᣰ ɯ 在线软
԰
补足ᤥ 反应程序设计如下᧥ँጢ ቩ ᖔሕ ቝᔽႿଫँጢ ቩ ᖔ 件预测蛋白磷酸化位点ଫ使用 ᥘጶ᥈ዶᤃ঎ԡ 构建系统和
࿗ጢ༁ᖔጢऐ ቩ ᖔ࿗ጢ ༁ᖔᎮ԰ ቩ ᖔ԰ ቝᔽႿᖔሕጢ 个循环ଫᎮ԰ ቩ 延 进化树ଫ使用 ᧕શዶᥘዶશ 进行多序列比对ᤥ
伸 ϟԡ ቝᔽႿᤥ ۪ऊ኏ 产物用 ϟᠮ琼脂糖凝胶电泳检测 ϓॹጇ 荧光定量 ۗࣷቴ
后ᖔ纯化回收得到目的片段ᖔ使用 ᡱᥘ᧕ϟँ᥋ఋ 载体进 根据荧光定量引物设计方法ᖔ用 ۪ʢᔽቝᔀʢ ጢ঎ԡ 设
行目的片段的连接后转化大肠杆菌 ᧕̀ጢም 感受态 计引物 ी኏੫ऊ᧕۪᣽᥋èܦी኏੫ऊ᧕۪᣽᥋኏ᖔ以 ௴ᔠۗ࿗ϟ 为内参
细胞ᖔ转化后产物于含氨苄青霉素的 ᓂା 固体培养 基因ᤥ 参照荧光定量 ۪ऊ኏ 试剂盒的步骤ᖔ配成 ԰ԡ
基上 ሕᎮ ቩ 培养过夜后筛选白斑ᖔ菌液经 ۪ऊ኏ 验证 ဂᓂ 的体系᧥԰ġ୩ɟା኏ ᥈ʢᔀᔀႿ ۪ऊ኏ ᥘᑕ༁ᡷᔀʢ ᥘᔽ଴ ϟԡ ဂᓂܦ

后送至生工生物工程股份有限公司测序ᤥ 引物 各 ԡ঎ ࿗ ဂᓂܦ ͐શ ኏ᆍ଴ ኏ᔀ஦ᔀʢᔀႿዹᔀ ᧕ᢃᔀ ԡ঎ ϟ ဂᓂܦ
ϓॹ྽ 地黄 ࣷᦵۗᣞ 基因的生物信息学分析 ʛʛ̀ ᨃᎮ঎ϟ ဂᓂܦ模板 ዹ᧕શዶ ԰ ဂᓂᤥ ۪ऊ኏ 反应程序如
԰
使用 ᨃ኏è èᔽႿʛᔀʢ ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ᣰ ᣰ औऔऔ঎ ᤦᔽᆍᔽႿ஦ᆍʢቝᑕᡷᔽዹ༁঎ 下᧥预变性 ँጢ ቩ ԰ԡ ༁ᖔ变性 ँጢ ቩ ϟ ༁ᖔ退火 ጢᤃ ቩ
ᆍʢ੫ ᣰ ༁ቝ༁԰ ᣰ ᆍʢ஦ᡸ஦ᔽႿʛ঎ၤᡷቝ᤟ɯ 进行开放阅读框查找ଫ使用 ԰ԡ ༁ᖔ延伸 ँጢ ቩ ϟ ༁ᖔ࿗ԡ 个循环ଫᤃԡ ቩ ԰ԡ ༁ᖔँጢ ቩ ϟ
ାᓂዶ୩ఋྉ ၤᡷᡷᡱ༁᧥ᣰ ᣰ ᤦ᤟ᑕ༁ᡷ঎ Ⴟዹᤦᔽ঎ Ⴟ᤟ቝ঎ Ⴟᔽၤ঎ ੫ᆍ׹ ᣰ ା᤟ᑕ༁ᡷ঎ ዹ੫ᔽɯ 进 ༁ 进行扩增ᤥ 反应结束后ᖔ根据得到的 ऊᡷ 值ᖔ利用
ͱ᪵᪵ऊᡷ
行序 列的同源性 搜 索ଫ 使用 ۪ʢᆍᡷᡱᑕʢᑕቝ ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ᣰ ᣰ ԰ ᖔ分别计算不同组织的表达量ᤥ
表 ϓই 引物序列及用途
ఋᑕᤦ᤟ᔀ ϟজ ۪ʢᔽቝᔀʢ ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀ༁ ᑕႿʛ ࣼ༁ᔀ

引物名称 引物序列 用途 扩增子大小
۪ʢᔽቝᔀʢ Ⴟᑕቝᔀ ۪ʢᔽቝᔀʢ ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀ В༁ᔀ ዶቝᡱ᤟ᔽ஦ᔽᔀʛ ᤟ᔀႿ੫ᡷၤ ྉᤦᡱɯ

኏੫ऊ᧕۪᣽᥋è ᥈ዶ᥈ዶዶዶఋ᥈᥈᥈ఋዶ᥈ऊఋ᥈ఋఋ 基因克隆 ϟऐԡऐ
᥈ᔀႿᔀ ዹ᤟ᆍႿᔀ
኏੫ऊ᧕۪᣽᥋኏ ఋऊዶऊዶዶ᥈ऊ᥈ऊऊఋఋऊዶዶዶዶ
ी኏੫ऊ᧕۪᣽᥋è ఋऊఋऊዶ᥈ዶዶዶऊዶዶ᥈ऊऊऊ᥈ዶऊఋ 荧光定量 ϟጢ࿗
኏ᔀᑕ᤟᥋ᡷᔽቝᔀ ۪ऊ኏
ी኏੫ऊ᧕۪᣽᥋኏ ఋఋऊዶऊऊఋऊऊఋఋऊఋऊ᥈ዶዶऊऊऊ
ఋᔽ۪࿗ϟ᥋è ዶఋఋ᥈᥈᥈ఋዶ᥈ዶఋఋ᥈ऊऊዶ᥈᥈ዶ᥈ 荧光定量内参 ϟԡᤃ
኏ᔀ஦ᔀʢᔀႿዹᔀ ੫ᔀႿᔀ ᆍ஦ ʢᔀᑕ᤟᥋ᡷᔽቝᔀ ۪ऊ኏
ఋᔽ۪࿗ϟ᥋኏ ऊऊዶఋఋ᥈ऊዶ᥈ऊऊዶዶఋఋऊዶఋऊ

见三条清晰条带ᖔ条带无降解及杂带ᖔ说明 ኏શዶ
԰জ 结果与分析 质量较高ᖔ无降解ᖔ可用于后续实验ᤥ 如图 ϟ 所
示ᖔ特异性条带长度约为 ϟ ऐԡԡ ᤦᡱᤥ 将 ۪ऊ኏ 产物
ԣॹϓ ቴ੖ࣷᦵۗᣞ 基因的克隆 克隆到 ᡱᥘ᧕ϟँ᥋ఋ 载体后挑选阳性克隆双向测序ᤥ
提取后的 ኏શዶ 经 ϟᠮ琼脂糖凝胶电泳检测可 测序结果拼接后经 ᨃ኏è èᔽႿʛᔀʢ 预测ᖔ该序列含有