Page 136 - 《广西植物》2020年第9期
P. 136
９ 期 郑鹏等: 沙棘果油对过氧化氢诱导氧化损伤的保护作用 １ ３ ５ １
段能够直接测定的方法却相当有限ꎬ因此迫切需 水乙 醇)、 阴 性 对 照 ( １００ μＬ 无 水 乙 醇 ＋ １００ μＬ
要开发直接测定 ＲＯＳ 或其他自由基的检测方法 ＤＰＰＨ 工作液)ꎮ 避光常温下放置 ２０ ｍｉｎꎬ通过紫
(吕惠萍等ꎬ２０１５)ꎮ 本研究通过 Ｈ Ｏ 氧 化 刺 激 外－可见分光光度法测定在 ５１７ ｎｍ 吸光度ꎬ 取平
２ ２
ＲＡＷ２６４.７ 细胞建立氧化损伤的细胞模型ꎬ并对沙 均值ꎮ 根据公式计算每个浓度的 ＤＰＰＨ 清除率ꎬ
棘果油进行干预ꎬ先通过细胞存活率等指标的检 做折线图ꎮ
测ꎬ再通过荧光探针( ＤＨＥ) 检测细胞内超氧化物 计算公式:清除率(％) ＝ [(１－( Ａ 样品 －Ａ 空白 ) /
阴离子水平ꎬ检测 ＤＨＥ 阳性细胞比例ꎬ间接反映 Ａ 对照 )] × １００ ％ꎮ
体内 ＲＯＳ 水平ꎬ从多角度探讨沙棘果油对氧化损 １.２.２ ＲＡＷ２６４.７ 细胞培养 将 ＲＡＷ２６４.７ 细胞置
伤的治疗ꎬ以期为人们正确认识沙棘果油的保健 于含有 １０％ＦＢＳ、１％Ｐ / Ｓ 的 １６４０ 培养基以及在温
功能 特 性 以 及 沙 棘 果 油 产 品 的 研 发 提 供 理 论 度 ３７ ℃ 、５％ ＣＯ 的培养箱中进行孵育ꎬ取对数生
２
依据ꎮ ４
长期细胞用培养基调整细胞浓度为 １×１０ 个待用ꎮ
１.２.３ ＭＴＴ 溶液的配制 用生理盐水溶解 １ ｇ 的
１ 材料与方法 ＭＴＴ 固体ꎬ定容ꎬ配制成 ５ ｍｇｍＬ ꎬ在无菌环境
￣１
下过 ０.２２ μｍ 滤膜除菌分装ꎬ尽量避光ꎬ存放于－４
１.１ 材料
℃ 的冰箱下备用ꎮ
１.１.１ 样品和试剂 样品:ＲＡＷ２６４.７ 细胞( 小鼠单
１.２.４ Ｈ Ｏ 氧化损伤模型建立 将培养基重悬细
核巨噬细胞)ꎬ由中国科学院上海分院细胞库提 ２ ２
６
胞接种于 ９６ 孔板中( 每板细胞数量约 １×１０ 个)ꎮ
供ꎮ 试剂:细胞培养试剂和消耗材料购于 Ｇｉｂｃｏ 公
每孔加 ２００ μＬ 培养基ꎬ摇匀ꎬ过夜培养ꎮ 第二天ꎬ
司ꎻ胰蛋白酶、过氧化氢、３￣(４ꎬ５￣二甲基噻唑￣２)￣
吸出每孔废液ꎬ通过 １.２ 的 ＤＰＰＨ 实验可以发现ꎬ
２ꎬ５￣二苯基四氮唑溴盐( ＭＴＴ) 购于国药集团化学
沙棘果油在浓度 ５％ 以下均有较好的抗氧化性ꎮ
试剂有限公司ꎻ沙棘果油购于山西五台山沙棘制
分 别 加 入 浓 度 为 ５. ０００％、 ２. ５００％、 １. ２５０％、
品有限公司ꎻ培养基购于 Ｈｙｃｌｏｎｅ 公司ꎻ９６ 孔板购
０.６２５％、０.３１３％、０.１５６％的 Ｈ Ｏ 培养基ꎮ 每组有
于 Ｃｏｒｎｉｎｇ 公 司ꎻ 超 氧 化 物 阴 离 子 荧 光 探 针 ２ ２
(ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍꎬ ＤＨＥ)购于碧云天生物技术研究 一个空白对照ꎮ ２４ ｈ 后加入每孔 ２００ μＬ 的 ＭＴＴ
￣１
(５ ｍｇｍＬ ) 培养基ꎮ 放置 ４ ｈ(３７ ℃ ꎬ５％ ＣＯ )
所ꎻ其他试剂均为国产分析纯ꎮ ２
１.１.２ 设备 二氧化碳孵育箱( ＨＥＲＥ ｃｅｌｌ１５０) 购 后每孔加入 １５０ μＬ ＤＭＳＯꎮ 用摇床摇 １０ ｍｉｎ(３７
℃ )后使用酶标仪在 ４９０ ｎｍ 处检测吸光度ꎬ得出
于 Ｔｈｅｒｍｏ 公司ꎻ酶标仪 ( ＡＤ３４０) 购于 Ｂｅｃｋｍａｎｎ
适于实验的 Ｈ Ｏ 浓度后使用不会明显影响细胞生
公司ꎻ流式细胞仪(ａｃｃｕｒｌ Ｃ６)购于 ＢＤ 公司ꎮ ２ ２
１.２ 方法 长的沙棘果油浓度进行 ＭＴＴ 实验ꎮ
１.２.５ 沙棘果油对 Ｈ Ｏ 氧化损伤的作用 通过
１.２.１ ＤＰＰＨ 自由基清除实验 以维生素 Ｃ 这个天 ２ ２
然的抗氧化剂作为阳性对照ꎬ采用 ＤＰＰＨ 法评估 １.２.４ 找出最适 Ｈ Ｏ 浓度溶解后ꎬ将沙棘果油按照
２
２
沙棘果油体外的抗氧化活性ꎬ为沙棘果油体内抗 ６.２５０％、３.１２５％、１.５６３％、０.７８１％、０.３９０％的浓度
梯度加入 Ｈ Ｏ 培养基中作为实验组ꎬ以合适浓度
氧化能力的检测提供浓度依据ꎮ ２ ２
取 ６％沙棘果油(无水乙醇溶解) 为样品ꎬ设置 的Ｈ Ｏ 损伤为阴对照组ꎬ以每孔 ２００ μＬ 培养基为
２
２
维生素 Ｃ( 标准溶液ꎬ６％ꎬ超纯水溶解) 为阳性对 空白组ꎮ 每 孔 ２００ μＬ 培 养 基ꎬ 摇 匀ꎬ 过 夜 培 养ꎮ
照ꎮ 沙棘果油与维生素 Ｃ 各设置 ６ 个浓度梯度ꎬ 将每孔 废 液 吸 出ꎬ 每 孔 加 入 ２００ μＬ 的 ＭＴＴ ( ５
即 ６％、３％、１. ５％、０. ７５％、０. ３７５％、０. １８７５％ꎮ 取 ｍｇｍＬ ) 培养基ꎮ 每组 ６ 个复孔ꎬ放置 ４ ｈ( ３７
￣１
９６ 孔板ꎬ每个浓度梯度设置 ８ 个复孔ꎬ每个孔先加 ℃ ꎬ５％ ＣＯ ) 后 吸 出 废 液ꎬ 每 孔 加 入 １５０ μＬ
２
入 １００ μＬ 样品溶液后加入 ＤＰＰＨ(０.２４％乙醇溶 ＤＭＳＯꎮ 用摇床摇 １０ ｍｉｎ(３７ ℃ ) 后使用酶标仪在
液)ꎮ 设置空白对照(１００ μＬ 样品溶液＋１００ μＬ 无 ４９０ ｎｍ 处检测吸光度ꎮ 实验重复 ３ 次ꎮ
