Page 161 - 《广西植物》2023年第1期
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１ 期 霍晓敏等: 黔产大青化学成分及其抗菌活性研究 １ ５ ７
１.２ 方法 Ｆｒ.Ｂ３￣３ꎬ取 Ｆｒ. Ｂ３￣２ 经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 柱( 甲醇)
１.２.１ 提取与分离 将 ２５ ｋｇ 干燥的大青( 地上部 分离和硅胶(二氯甲烷 ∶ 甲醇 ＝ ３０ ∶ １ ~ １ ∶ １)梯度
分)粉碎ꎬ用 ９５％乙醇热回流提取 ３ 次ꎬ每次 ２ ｈꎬ 洗脱ꎬ得 到 化 合 物 １２ ( ２７. ４ ｍｇ)ꎮ Ｆｒ. Ｃ１ 经 反 相
提取液合并ꎬ经减压浓缩后得到粗浸膏 １ １３６ ｇꎮ ＲＰ￣１８ 柱分离和甲醇－水(３０％ ~ １００％) 梯度洗脱ꎬ
粗浸膏用水混悬ꎬ得到悬浮液ꎬ然后依次用等体积 得 到 Ｆｒ. Ｃ１￣１ ~ Ｆｒ. Ｃ１￣５ꎮ 取 Ｆｒ. Ｃ１￣２ 经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ
的石油醚、二氯甲烷、正丁醇进行萃取ꎬ之后分别 ＬＨ￣２０ 柱(甲醇)分离和半制备高效液相色谱( 乙
对其进行减压浓缩得到石油醚部位 １７２ ｇꎬ二氯甲 腈 ∶ ０.１％磷酸水溶液 ＝ １８ ∶ ８２) 纯化后得到化合
烷部位 ４１ ｇꎬ正丁醇部位 ４２９ ｇꎬ水部位 ３７３ ｇꎮ 物 １３(２１.１ ｍｇ)、１４(１５.３ ｍｇ)ꎮ Ｆｒ.Ｃ２ 经反相 ＲＰ￣
取石油醚部位 １０３ ｇꎬ经硅胶柱( 石油醚 ∶ 乙 １８ 柱分离和甲醇－水(３０％ ~ １００％) 洗脱后ꎬ得到
酸乙酯 ＝ ２００ ∶ １、１００ ∶ １、５０ ∶ １、２０ ∶ １、５ ∶ １、 Ｆｒ.Ｃ２￣１~ Ｆｒ.Ｃ２￣４ꎮ取 Ｆｒ.Ｃ２￣１ 经 ２ 次 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣
１ ∶ １)梯度洗脱ꎬ得到 １３ 个不同流分ꎬ石油醚 ∶ 乙 ２０ 柱(二氯甲烷 ∶ 甲醇 ＝ １ ∶ １)、硅胶柱( 二氯甲
酸乙酯 ＝ ２００ ∶ １ 洗脱得到流分 Ｆｒ.ａꎬ石油醚 ∶ 乙 烷 ∶ 甲醇 ＝ ２０ ∶ １)洗脱得到化合物 １５(３７.４ ｍｇ)ꎻ
酸乙酯 ＝ １００ ∶ １ 洗脱得到流分 Ｆｒ.ｂ１￣２ꎬ石油醚 ∶ 取 Ｆｒ. Ｃ２￣２ 经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 柱( 二氯甲烷 ∶ 甲
乙酸乙酯 ＝ ５０ ∶ １ 洗脱得到流分 Ｆｒ.ｃ１￣２ꎬ石油醚 ∶ 醇 ＝ １ ∶ １)、硅胶柱( 二氯甲烷 ∶ 甲醇 ＝ １２ ∶ １) 洗
乙酸乙酯 ＝ ２０ ∶ １ 洗脱得到流分 Ｆｒ.ｄ１￣３ꎬ石油醚 ∶ 脱ꎬ反复重结晶得到化合物 １６(２９.５ ｍｇ)ꎻ取 Ｆｒ.
乙酸乙酯 ＝ ５ ∶ １洗脱得到流分 Ｆｒ.ｅ１￣３ꎬ石油醚 ∶ Ｃ２￣３ 经两 次 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 柱 ( 二 氯 甲 烷 ∶ 甲
乙酸乙酯 ＝ １ ∶ １ 洗脱得到流分 Ｆｒ.ｆ１￣２ꎮ Ｆｒ.ｂ１ 经 醇 ＝ １ ∶ １)、 半 制 备 高 效 液 相 色 谱 ( 水 ∶ 甲 醇 ＝
反复重结晶得到化合物 １(５８９.５ ｍｇ)ꎻＦｒ.ｂ２ 经硅 ５６ ∶ ４４)洗脱ꎬ得到化合物 １７(７.７ ｍｇ)ꎮ Ｆｒ.Ｃ３ 经
胶柱(石油醚 ∶ 乙酸乙酯 ＝ ５０ ∶ １)、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣ 反相 ＲＰ￣１８ 柱分离和甲醇－水(３５％ ~ １００％) 洗脱
２０ 柱(二氯甲烷 ∶ 甲醇 ＝ １ ∶ １) 洗脱得到化合物 ２ 后ꎬ得到 Ｆｒ.Ｃ３￣１~ Ｆｒ.Ｃ３￣４ꎮ 取 Ｆｒ.Ｃ３￣３ 经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ
(８.４ ｍｇ)、３(１０.２ ｍｇ)ꎮ Ｆｒ.ｄ１ 经反复重结晶得到 ＬＨ￣２０ 柱(甲醇)、硅胶柱( 二氯甲烷 ∶ 甲醇 ＝ ２０ ∶
化合物 ４(１１４.２ ｍｇ)ꎻＦｒ.ｄ２ 经硅胶柱(石油醚 ∶ 乙 １)洗脱ꎬ得到化合物 １８(５３.２ ｍｇ)ꎮ
酸乙酯 ＝ ３０ ∶ １)、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 柱( 二氯甲烷 ∶ １.２.２ 抗菌活性实验 抗菌活性测定参考课题组
甲醇 ＝ １ ∶ １)洗脱得到化合物 ５(７.２ ｍｇ)ꎻＦｒ.ｄ３ 经 前期建立的一种定量检测细菌活菌数的 ＭＴＴ 方法
硅胶柱(石油醚 ∶ 乙酸乙酯 ＝ ２０ ∶ １) 洗脱得到化 (马林玉等ꎬ２０２１)ꎬ取适量乳房链球菌、无乳链球
合物 ６(９.１ ｍｇ)ꎮ Ｆｒ.ｅ２ 经硅胶柱( 石油醚 ∶ 乙酸 菌分别接种于肉汤培养基ꎬ于 ３７ ℃ 培养 １２ ｈꎬ分
￣１
６
乙酯 ＝ １０ ∶ １) 洗脱得到化合物 ７(９.８ ｍｇ)ꎮ Ｆｒ.ｆ１ 别将菌液稀释至 １０ ＣＦＵｍＬ ꎬ备用ꎮ 取 ９６ 孔培
经硅 胶 柱 ( 二 氯 甲 烷 ∶ 甲 醇 ＝ ３０ ∶ １ )、 ２ 次 养板ꎬ每孔加入菌液 ９０ μＬꎬ将 ９６ 孔板划分 ＤＭＳＯ
Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 柱(二氯甲烷 ∶ 甲醇 ＝ １ ∶ １) 洗脱 阴性对照组、氨苄青霉素阳性对照组和 ８ 个浓度
得到化合物 ８(１８.３ ｍｇ)ꎻＦｒ.ｆ２ 经硅胶柱( 二氯甲 的给药组ꎬ每组设置 ３ 个复孔ꎬ取 １０ μＬ 样品溶液
烷 ∶ 甲醇 ＝ ３０ ∶ １)洗脱得到化合物 ９(５２.１ ｍｇ)ꎮ 加入给药组各孔ꎮ 于 ３７ ℃ 暗培养 ２４ ｈ( 无乳链球
取正丁醇部位 ３９７ ｇꎬ经大孔树脂 Ｄ１０１ 柱以 菌无氧环境)ꎮ 每孔加入 ４５ μＬ ０.５ ｍｇｍＬ ＭＴＴ
￣１
乙醇(３０％、５０％、７０％、９０％、１００％) 梯度洗脱ꎬ得 溶液ꎮ 空白凋零组加入与 ＭＴＴ 等量的 ＰＢＳꎬ继续
￣１
到 １１ 个不同流分ꎬ３０％乙醇洗脱流分 Ｆｒ.Ａꎻ５０％乙 避光培养 ４ ｈꎮ 显色的菌液离心(１２ ０００ ｒｍｉｎ 、
４ ℃ 、１０ ｍｉｎ)ꎬ弃上清液ꎬ加入 １２５ μＬ ＤＭＳＯꎮ 向
醇洗脱流分 Ｆｒ.Ｂ１￣３ꎻ７０％乙醇洗脱流分 Ｆｒ.Ｃ１￣４ꎻ
９０％乙醇洗脱流分 Ｆｒ. Ｄ１￣２ꎻ１００％ 乙醇洗脱流分 已完全溶解的产物中加入 １５０ μＬ 的 ＳＤＳꎬ取 ２００
Ｆｒ. Ｅꎮ Ｆｒ. Ｂ２ 经 反 相 ＲＰ￣１８ 柱 分 离ꎬ 甲 醇 － 水 μＬ 混合溶液转移至 ９６ 孔板中ꎬ用全自动酶标仪
(３５％ ~ １００％) 梯度洗脱ꎬ得到 Ｆｒ. Ｂ２￣１ ~ Ｆｒ. Ｂ２￣４ꎮ 测定 ＯＤ ５７０ ꎮ
取 Ｆｒ.Ｂ２￣３ 经 ２ 次 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 柱(甲醇)洗脱ꎬ
得到化合物 １１(１１.７ ｍｇ)ꎻ经半制备高效液相色谱 ２ 结果与分析
(Ｃ 柱ꎬ水 ∶ 乙腈 ＝ ７８ ∶ ２２) 分离ꎬ得到化合物 １０
１８
(１９.２ ｍｇ)ꎮ 取 Ｆｒ. Ｂ３ 经反相 ＲＰ￣１８ 柱分离和甲 ２.１ 结构鉴定
醇－ 水 ( ３５％ ~ １００％) 梯 度 洗 脱ꎬ 得 到 Ｆｒ. Ｂ３￣１ ~ 化合物 １ 无 色 针 状 结 晶ꎬＣ Ｈ Ｏꎬ ＥＳＩ￣ＭＳ
３０
５０
