Page 180 - 《广西植物》2023年第1期
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１ ７ ６ 广 西 植 物 ４３ 卷
源(ＥＳＩ)等ꎻ数据的采集和处理采用 ＭａｓｓＬｙｎｘ ４.１ 重复孔ꎮ ２４ ｈ 后ꎬ收集上清液ꎬ并采用 Ｇｒｉｅｓｓ 法测
质 谱 工 作 站ꎻ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ 色 谱 柱 定 ＮＯ 含量ꎬ用酶标仪检测 ５４０ ｎｍ 下的吸光度ꎮ
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(２.１ ｍｍ × １００ ｍｍꎬ １.７ μｍꎬ 美国 Ｗａｔｅｒｓ 公司)ꎻ ２.１.５ 统计学方法 采用 ＳＰＳＳ ２０.０ 软件进行统计
Ｓ３０Ｈ￣Ｄ７８２２４ 型超声清洗器( 德国 Ｅｌｍａ Ｓｏｎｉｃ 公 分析ꎬ数据结果用 ｘ±ｓ 表示ꎮ 多组数据之间比较采
司)ꎻ ＡＬ２０４ 型 分 析 天 平 ( 瑞 士 Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ 公 用单因素方差分析ꎬＰ<０.０５ 为差异有统计学意义ꎮ
司)ꎻ ３１１１ 型 ＣＯ 培 养 箱 ( 美 国 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ２.２ 差异成分分析处理
２
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公 司)ꎻ ＡＣ２￣４Ｓ１ 生 物 安 全 柜 ( 新 加 坡 ２.２.１ 色谱检测条件 ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ 色
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ＥＳＣＯ 公司)ꎻＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯ 多功能酶标仪( 瑞
谱柱(２.１ ｍｍ × １００ ｍｍꎬ１.７ μｍ)ꎬ采用 ０.５ ｍＬ
士 ＴＥＣＡＮ 公司)ꎮ ｍｉｎ 的流速进行洗脱ꎬ进样体积设定为 １ μＬꎬ样品
￣１
１.３ 细胞
浓度为 ２ ｍｇｍＬ ꎮ 流动相由含有 ０.１％甲酸水溶
￣１
ＲＡＷ２６４.７ 细胞购自中国科学院上海生命科
液(Ａ) －乙腈(Ｂ)组成ꎬ洗脱程序如下:０ ~ １.００ ｍｉｎ
学研究院细胞资源中心ꎮ
５％ ~ １８％ Ｂꎻ１.００ ~ ２.５０ ｍｉｎ １８％ ~ ２０％ Ｂꎻ２.５０ ~
４.５０ ｍｉｎ ２０％ ~ ２５％ Ｂꎻ４.５０ ~ ５.００ ｍｉｎ ２５％ ~ ７０％
２ 研究方法
Ｂꎻ５.００ ~ ７. ００ ｍｉｎ ７０％ ~ ７５％ Ｂꎻ７. ００ ~ ９. ５０ ｍｉｎ
７５％ ~ ９８％ Ｂꎻ ９. ５０ ~ １１. ５０ ｍｉｎ ９８％ ~ ５％ Ｂꎻ
２.１ 体外 ＮＯ 抑制活性测试
１１.５０ ~ １３.５０ ｍｉｎ ５％ Ｂꎮ
２.１.１ 供试品溶液的制备 分别取络石藤及地瓜藤
２.２.２ 质 谱 检 测 条 件 质 谱 仪 通 过 电 喷 雾 电 离
各 ０.２ ｇꎬ置于 ２０ ｍＬ ８０％甲醇－水溶液中室温下超
(ＥＳＩ)源连接到 ＵＰＬＣ 系统ꎬ雾化气为氮气ꎬ质量
声提取 ２ 次ꎬ每次 ２０ ｍｉｎꎬ合并提取液静置 ３０ ｍｉｎꎬ
扫描范围 ｍ / ｚ １００ ~ １ ５００ꎬ累积时间 ０.２ ｓꎮ 毛细管
过 ０.４５ μｍ 微孔滤膜ꎬ即得各样品甲醇提取物ꎮ
电压在负离子模式下为 ２.４２ ｋＶꎬ在正离子模式下
２.１.２ 细胞及培养 将 ＲＡＷ２６４.７ 细胞加入 ＤＭＥＭ
为 ３.００ ｋＶꎬ样 品 锥 电 压 为 ２５ Ｖꎬ提 取 锥 电 压 为
培养基(含 １０％胎牛血清)中ꎬ置于 ５％ ＣＯ 、３７ ℃
２ ４ Ｖꎮ对于 ＭＳ / ＭＳ 谱图ꎬ优化了不同的碰撞能量
细胞 培 养 箱 中 培 养 １ ~ ２ ｄꎮ 当 细 胞 密 度 达 到
(２０ ~ ５０ ｅＶ)ꎬ以实现结构解析的最大特征片段
８０％ ~ ９０％时ꎬ按照 １ ∶ ２ 的比例传代ꎮ
数ꎮ 氮气用于雾化器和去溶剂化ꎬ去溶剂化和锥
２.１.３ 络石藤和地瓜藤醇提物对 ＲＡＷ２６４.７ 细胞的
形气体流速分别为 ８００、２０ Ｌｈ ꎬ去溶剂化温度
￣１
毒性考察 将 ＲＡＷ２６４.７ 细胞配置成浓度为 ６ ×
为 ５５０ ℃ ꎬ源温度为 １２０ ℃ ꎮ 数据的采集和处理
４ ￣１
１０ 个ｍＬ 的细胞悬液ꎬ每孔 １００ μＬ 接种于 ９６
孔板上ꎬ放入 ３７ ℃ 、５％ ＣＯ 的培养箱中 ２４ ｈꎬ设置 软件为 ＭａｓｓＬｙｎｘ ４.１ 质谱工作站ꎮ
２
对照组(仅含培养基) 和给药组( 含不同浓度络石 ２.２. ３ ＯＰＬＳ￣ＤＡ 差 异 性 成 分 分 析 以 ＵＰＬＣ￣Ｑ￣
ＴＯＦ￣ＭＳ / ＭＳ 采集所得络石藤和地瓜藤色谱图中峰
藤醇提物、地瓜藤醇提物)ꎬ每组 ３ 个重复孔ꎮ ２４ ｈ
面积量化值为 变 量ꎬ 采 用 ＳＩＭＣＡ １４. １ 软 件 进 行
后ꎬ除去孔内培养基ꎬ每孔添加 １００ μＬ 含有 ０. ５
ｍｇｍＬ –１ ＭＴＴ 的培养基ꎬ于孵箱中培养 ４ ｈ 后弃 ＯＰＬＳ￣ＤＡ 分析ꎬ络石藤和地瓜藤样品呈现一定分类
去培养基ꎬ每个孔中添加 １００ μＬ 二甲基亚砜ꎮ 在 聚集现象ꎮ ＯＰＬＳ￣ＤＡ 模型中变量投影重要度(ＶＩＰ
酶标仪 ４９０ ｎｍ 波长下测量吸收波长ꎬ并计算细胞 值)越大ꎬ表明该指标对区分络石藤和地瓜藤的贡
献越大(崔婷等ꎬ２０２２)ꎬ即可能是区分两种药材的
存活率ꎮ
细胞存活率 ＝ (Ａ 给药 / Ａ 对照 ) ×１００％ 差异性成分ꎬ确定络石藤与地瓜藤间的差异性化学
２.１.４ ＮＯ 释放量的检测 将 ＲＡＷ２６４.７ 细胞配置 成分ꎮ 利用 ＭａｓｓＬｙｎｘ ４.１ 色谱工作站得到化合物的
５ ￣１ 精确相对分子质量及化合物碎片信息ꎬ参照对照品
成浓度为 １.５×１０ 个ｍＬ 的细胞悬液ꎬ每孔 １００
μＬ 接种于 ９６ 孔板上ꎬ放入 ３７ ℃ 、５％ ＣＯ 的培养 并查阅相关文献(范明松等ꎬ２００５ꎻ袁珊琴等ꎬ２０１０ꎻ
２
箱中 １２ ｈꎬ设置空白对照组(仅含培养基)、ＬＰＳ 模 景玲等ꎬ２０１２ꎻＬｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７ꎻ
型组(含 ２ μｇｍＬ –１ ＬＰＳ) 和给药组(２ μｇｍＬ –１ Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８ꎻ Ｍｕｒｕｇｅｓｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１ꎻ Ｓｏｎｇ ｅｔ
ＬＰＳ、ＬＰＳ＋吲哚美辛、ＬＰＳ＋不同浓度络石藤醇提物 ａｌ.ꎬ ２０２２ꎻ Ｙａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２) 结合 Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ 软
和 ＬＰＳ＋不同浓度地瓜藤醇提物)ꎬ每组设置 ３ 个 件ꎬ鉴定络石藤与地瓜藤的差异性成分ꎮ
