Page 66 - 《广西植物》2023年第11期
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２ ０ ２ ６ 广 西 植 物 ４３ 卷
究 员 鉴 别 为 红 树 科 ( Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａｃｅａｅ ) 木 榄 属 １０ ∶ １、５ ∶ １、２０ ∶ ７、０ ∶ １０ꎬＶ ∶ Ｖ) 梯度洗脱ꎬ收集
(Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ) 木榄( Ｂ. ｇｙｍｎｏｒｈｉｚａ) 的胚轴ꎬ标本保 到 １３ 个组分[Ｚ(１)ꎻＺ２(２ ~ ３)ꎻＺ３(４ ~ ８)ꎻＺ４(９)ꎻ
藏于广西中医药大学海洋药物研究院ꎬ标本编号 Ｚ５(１０ ~ ２０)ꎻＺ６( ２１ ~ ２８)ꎻＺ７ ( ２９ ~ ３３)ꎻＺ８ ( ３４ ~
为 ＧＸＩＭＤ Ｍ２０１９０５１７ꎮ ３７)ꎻＺ９ ( ３８ ~ ４３)ꎻＺ１０ ( ４４ ~ ５７)ꎻ Ｚ１１ ( ５８ ~ ６３)ꎻ
１.２ 提取分离 Ｚ１２(６４ ~ ８２)ꎻＺ１３(８３)]ꎮ 组分 Ｚ３ 经硅胶柱色谱
木榄胚轴新鲜样品( 湿重约 ６２. ０ ｋｇ)ꎬ使用 分离ꎬ以 氯 仿 － 甲 醇 系 统 ( １０ ∶ ０、１０ ∶ １、１０ ∶ ２、
９５％工业酒精( 料液比 １ ∶ ３) 浸泡提取 ３ 次ꎬ每次 １０ ∶ ４、１０ ∶ １０、０ ∶ １０ꎬＶ ∶ Ｖ) 系统洗脱ꎬ得 ６ 个组
７ ｄꎬ过滤取滤液ꎬ将滤液合并ꎬ减压浓缩得到浸膏 分( ｄ１ ~ ｄ６)ꎬ 其 中 ｄ３ 经 半 制 备 ＨＰＬＣ ( ＭｅＯＨ ∶
状提取物ꎮ 依次使用等体积石油醚、乙酸乙酯、正 Ｈ Ｏ ＝ １０ ∶ ９０ꎬＶ ∶ Ｖ)纯化后得化合物 ７ (２.３ ｍｇꎬ
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丁醇萃取ꎬ分别依次萃取 ３ 次ꎬ浓缩后得到石油醚 ｔ ＝ １３. ５６ ｍｉｎ)、 化 合 物 ８ ( １. ６ ｍｇꎬ ｔ ＝ １９. １８
Ｒ Ｒ
部位(１２７.２０ ｇ)、乙酸乙酯部位(１７８.０６ ｇ)、正丁 ｍｉｎ)、化合物 ４ (１.１ ｍｇꎬｔ ＝ ２１.８９ ｍｉｎ)ꎮ 组分 Ｚ４
Ｒ
醇部位(６２６.００ ｇ)和水部位(１ ２１４.００ ｇ)ꎮ 经硅胶柱色谱分离ꎬ以 氯 仿 － 甲 醇 系 统 ( １０ ∶ ０、
１.３ 抗 ＨＢＶ 活性部位筛选 １０ ∶ １、１０ ∶ ２、１０ ∶ ４、１０ ∶ ８、０ ∶ １０ꎬＶ ∶ Ｖ) 梯度洗
通过检测体外 ＨｅｐＧ２.２.１５ 细胞上清液中分泌 脱ꎬ得 ７ 个组分( ｅ１ ~ ｅ７)ꎬ其中组分 ｅ４ 经半制备
的 ＨＢＶ ＤＮＡ 的含量ꎬ以抑制 ＨＢＶ ＤＮＡ 分泌能力 ＨＰＬＣ 纯化后ꎬ在梯度ＭｅＯＨ ∶ Ｈ Ｏ ＝ ２０ ∶ ８０( Ｖ ∶
２
大小ꎬ来确定木榄胚轴不同提取部位的抗 ＨＢＶ 活 Ｖ)处得 化 合 物 １０ ( ３. ２ ｍｇꎬｔ ＝ ２１. ５２ ｍｉｎ)ꎬ 在
Ｒ
性ꎮ 步骤如下ꎮ (１)各部位药液配制:精密称取各 ＭｅＯＨ ∶ Ｈ Ｏ ＝ ４０ ∶ ６０(Ｖ ∶ Ｖ)处得化合物 １１(２.４
２
部位粗提物 １ ｍｇꎬ使用适量 ＤＭＳＯ 溶解后ꎬ加入细 ｍｇꎬｔ ＝ ３０.５２ ｍｉｎ)ꎮ 组分 Ｚ６ 在放置过程中出现
Ｒ
胞完全培养基稀释成 ５００、２５０、１２５ μｇｍＬ 浓度 白色结晶ꎬ多次重结晶后ꎬ经半制备 ＨＰＬＣ 分析为
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药液待用ꎮ (２) 细胞毒性评价:采用 ＭＴＴ 法检测 较纯单 体ꎬ 得 化 合 物 ５ ( １０. ２ ｍｇ)ꎮ 组 分 Ｚ１０ 经
木榄胚轴粗提物和各萃取部位对细胞的毒性作 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 葡聚糖凝胶柱层析色谱ꎬ以甲醇为
用ꎬ筛选出活性实验给药浓度ꎮ 将处于对数生长 洗脱溶剂ꎬ流经薄层板合并后得 １１ 个组分( ａ１ ~
期的 ＨｅｐＧ２.２.１５ 细胞以每孔 ５ ０００ 个接种于 ９６ ａ１１)ꎬ 其 中 组 分 ａ４ 经 半 制 备 ＨＰＬＣ ( ＭｅＯＨ ∶
孔板待其贴壁ꎬ加入各萃取部位不同浓度药液ꎬ同 Ｈ Ｏ ＝ ９５ ∶ ５ꎬＶ ∶ Ｖ) 纯化后ꎬ得化合物 １ (１０.０９
２
时设阴性对照组( Ｃｏｎｔｒｏｌ) 和拉米夫定(３ＴＣ) 阳性 ｍｇꎬ ｔ ＝ ７. ０８ ｍｉｎ)、 化 合 物 ２ ( ９. １４ ｍｇꎬ ｔ ＝
Ｒ Ｒ
￣１
组ꎮ 培养 ７２ ｈ 后 吸 弃 上 清 液ꎬ 加 入 ５ ｍｇ ｍＬ １７.３２)、化合物 ６ (６.６４ ｍｇꎬｔ ＝ ９.７９ ｍｉｎ)ꎬ组分
Ｒ
ＭＴＴ 溶液 ５０ μＬ 继续培养 ４ ｈꎬ吸弃旧液每孔加 ａ５ 经半制备 ＨＰＬＣ(ＭｅＯＨ ∶ Ｈ Ｏ ＝ ９５ ∶ ５ꎬＶ ∶ Ｖ)
２
ＤＭＳＯ １００ μＬꎬ充分振匀ꎮ 测 ４９０ ｎｍ 波长下 ＯＤ 纯化后ꎬ得化合物 ３ ( ４. ２３ ｍｇꎬｔ ＝ １３. ０５ ｍｉｎ)ꎮ
Ｒ
值ꎬ 计 算 细 胞 存 活 率ꎮ 细 胞 存 活 率 (％) ＝ 组分 Ｚ１３( 湿重 １５ ｇ) 经大孔树脂柱色谱( 流动相
(ＯＤ 实验组Ａ４９０值 / ＯＤ 阴性对照孔Ａ４９０值 ) × １００ꎮ ( ３) 抗 ＨＢＶ 分别为水、５０％甲醇、１００％ 甲醇ꎬ依次冲 ５ 个柱体
活性评价:利用实时荧光定量 ＰＣＲ 法( ＱＰＣＲ)ꎬ取 积)ꎬ得 ３ 个组分(ｂ１ ~ ｂ３)ꎬ其中组分 ｂ３ 经半制备
对数生长期 ＨｅｐＧ２.２.１５ 细胞ꎬ以每毫升 ５ × １０ 个 ＨＰＬＣ(ＭｅＯＨ ∶ Ｈ Ｏ ＝ ８０ ∶ ２０ꎬＶ ∶ Ｖ) 纯化后得化
５
２
的细胞密度接种于 ２４ 孔板上ꎬ２４ ｈ 贴壁后ꎬ实验 合物 ９(２.０１ ｍｇꎬｔ ＝ ２３.４５ ｍｉｎ)ꎮ
Ｒ
组更换含药培养液ꎬ阴性组加入完全培养基ꎬ继续 １.５ 单体化合物抗 ＨＢＶ 活性评价
培养ꎮ 第 ６ 天收集细胞上清液ꎬ按照病毒 ＤＮＡ 制 使 用 ＭＴＴ 实 验 方 法ꎬ 以 每 孔 ５ ０００ 个
备试剂盒的操作步骤获得高纯度的 ＨＢＶ ＤＮＡꎬ运 ＨｅｐＧ２.２.１５ 细胞铺于 ９６ 孔板ꎬ贴壁后ꎬ将分离得到
用乙型肝炎核酸定量检测试剂盒检测细胞上清液 的单体化合物稀释成 １００ μｇｍＬ ꎬ同时使用 １００
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ＨＢＶ ＤＮＡ 水平ꎮ ＨＢＶ ＤＮＡ 抑制率(％) ＝ ( 阴性 μｇｍＬ 拉米夫定(３ＴＣ) 作为阳性对照ꎬ另设阴性
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对照孔 ＨＢＶ ＤＮＡ 拷贝数－实验孔 ＨＢＶ ＤＮＡ 拷贝 对照组ꎮ 与给药 ７２ ｈ 后ꎬ酶标仪下 ４９０ ｎｍ 处测定
数) / 阴性对照孔 ＨＢＶ ＤＮＡ 拷贝数×１００ꎮ ＯＤ 值ꎬ并 计 算 细 胞 存 活 率ꎮ 细 胞 存 活 率 (％) ＝
１.４ 化学成分分离 (ＯＤ 实验组Ａ４９０值 / ＯＤ 阴性对照孔Ａ４９０值 )×１００ꎮ
取正丁醇萃取物(６２６.０ ｇ) 经硅胶拌样ꎬ采用 使用实时定量 ＰＣＲ 实验方法ꎬ将每孔 ５０ 万个
硅胶 柱 色 谱 分 离ꎬ以 ＣＨＣｌ ￣ＭｅＯＨ 系 统 ( １０ ∶ ０、 ＨｅｐＧ２.２.１５ 细胞铺于 ２４ 孔板ꎬ贴壁后ꎬ将分离得
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