Page 94 - 《广西植物》2023年第11期
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２ ０ ５ ４ 广 西 植 物 ４３ 卷
信息学ꎬ使得 ＥＳＴ( ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ) 为 ＳＳＲ １.２ ＲＮＡ 提取、ｃＤＮＡ 文库构建及基因功能注释
标记的开发提供了一种经济、方便的方法ꎮ 随着 以耐涝‘ＺＨＣ２’辣椒为试验材料ꎬ其培养及淹
测序技术的迅速 发 展ꎬＥＳＴ 数 量 逐 步 增 加ꎬ使 得 水处理参考郭豪等(２０２２) 的方法ꎮ 待辣椒植株长
ＥＳＴ￣ＳＳＲ 标 记 越 来 越 丰 富ꎮ 与 传 统 ＳＳＲ 相 比ꎬ 至 ５ 片叶时ꎬ分别进行淹水 ６ ｈ( Ｔ１)、淹水 ２４ ｈ
ＥＳＴ￣ＳＳＲ 具有开发便宜、共显性、稳定、通用性好 (Ｔ２)和恢复 １ ｈ(Ｔ３)３ 个处理ꎬ并以正常培养的辣
等优点ꎬ被广泛应用于基因标记( Ｖａｒｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ.ꎬ 椒材料作为对照( ＣＫ)ꎮ 试验包括 ３ 次生物学重
２００５ꎻ姜春 芽 等ꎬ ２００９)ꎮ 现 已 在 木 瓜 ( 伍 越 等ꎬ 复ꎬ每次生物学重复由 １０ 株长势一致的辣椒根系
２０２１)、香合欢( 安琪等ꎬ２０２２)、黄精( 陈友吾等ꎬ 混合而成ꎬ取样后立即放入液氮中快速冷冻ꎬ然后
®
２０２０)、龙 眼 ( 胡 文 舜 等ꎬ ２０１９)、 川 芎 ( 袁 灿 等ꎬ 放入－８０ ℃ 超低温冰箱中保存ꎬ使用 ＴＲＩｚｏｌ 试剂
２０１７)、红 麻 ( 万 雪 贝 等ꎬ ２０１７)、 枫 香 ( 李 辉 等ꎬ
盒[天根生化科技(北京) 有限公司] 提取总 ＲＮＡꎬ
２０２３)等植物上开发与应用ꎬ并广泛应用于分子标 用于转录组测序ꎮ 测序文库的构建在华大基因技
记辅助育种、基因定位、遗传多样性分析和遗传连 术服务有限公司进行ꎬ使用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００ 测
锁图谱的构建等研究ꎮ 已有研究基于公共数据库
序平台、Ｔｒｉｎｉｔｙ 软件分别进行转录组的双末端测
或转录组有限的辣椒 ＥＳＴ 序列开发了一些引物ꎬ
序、Ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 组装以及聚类去冗余ꎬ获得单基因
并在实践中得到了应用( 傅鸿妃等ꎬ２０１８ꎻ管俊娇
( Ｕｎｉｇｅｎｅ )ꎮ 对 ＤＥＧｓ 进 行 ＫＥＧＧ ( Ｋｙｏｔｏ
等ꎬ２０１９)ꎬ 但 辣 椒 可 公 开 获 得 的 ＳＳＲ 标 记 有 限
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ) 和 ＧＯ ( Ｇｅｎｅ
(Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０００)ꎬ已公开报道可利用的 ＳＳＲ
Ｏｎｔｏｌｏｇｙ)功能注释ꎬ对 Ｕｎｉｇｅｎｅ 与 ＮＴ( ＮＣＢＩ ｎｏｎ￣
标记仅有 ５００ 多个(李永平等ꎬ２０１６)ꎬ开发数量偏
ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ)、ＮＲ( ＮＣＢＩ
少ꎬ难以适应辣椒高密度作图的要求ꎬ亟需开发更
ｎｏｎ￣ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ )、
多的 ＳＳＲ 标记用于遗传图谱构建、种质鉴定以及
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、Ｐｆａｍ( ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ) 和 ＫＯＧ( ｅｕＫａｒｙｏｔｉｃ
分子辅助育种等ꎮ
Ｏｒｔｈｏｌｏｇ Ｇｒｏｕｐｓ)公共数据库中的序列进行同源性
本研究在水涝胁迫下从耐涝辣椒转录组数据
分析ꎮ
中 检 测 差 异 表 达 基 因 ( ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
１.３ 转录组 ＳＳＲ 位点鉴别和引物设计
ｇｅｎｅｓꎬ ＤＥＧｓ)ꎬ并对其进行组装与功能注释ꎻ通过
使用 ＭＩＳＡ Ｖ１.０ 在线软件测定 Ｕｎｉｇｅｎｅ 中的
ＲＮＡ￣ｓｅｑ 技术获得丰富的辣椒 ＳＳＲ 位点信息ꎬ进
ＳＳＲꎬ限定单核苷酸至六核苷酸序列 ＳＳＲ 的重复次
行辣椒 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物设计ꎬ随后采用 ＰＣＲ 扩增及
数至少为 １２ 个、６ 个、５ 个、５ 个、４ 个和 ４ 个ꎻ并限
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术筛选出多态性好、稳定
定复合微卫星形成的标准为两个微卫星之间的距
的辣椒 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物ꎬ并通过对不同辣椒品种的
遗传多样性进行分析以验证引物的应用效果ꎮ 拟 离小于 １００ ｂｐ(Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３)ꎮ 使用 Ｐｒｉｍｅｒ ３
在线工具设计引物(Ａｎｄｒｅａｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)ꎬ引物设
探讨:(１) 辣椒对水涝胁迫应答的分子机制ꎻ(２)
计原则:(１)引物长度为 １８ ~ ２４ ｂｐꎻ(２) 产物大小
辣椒 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 位点的分布及序列特征ꎻ(３) 辣椒多
为 ８０ ~ ３００ ｂｐꎻ(３) 退火温度为 ５５ ~ ６２ ℃ ꎬ上下游
态性 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物ꎮ 本研究以期为今后辣椒遗传
引物 退 火 温 度 差 值 小 于 ５ ℃ ꎻ ( ４) ＧＣ 含 量 为
图谱构建、种质资源评价、系统进化分析、功能基
４０％ ~ ６０％ꎻ避免引物二级结构的出现ꎮ 从中任意
因标记和分子辅助育种等研究奠定基础ꎮ
挑选 ３０ 对引物进行扩增ꎮ 引物由生工生物工程
１ 材料与方法 (上海)股份有限公司进行合成ꎮ
１.４ ＤＮＡ 提取和 ＰＣＲ 扩增
１.１ 材料 以‘ＺＨＣ１’‘ＺＨＣ２’ 和‘ 大方皱椒’ 为材料ꎬ待
植株长至 ５ 叶 １ 心时ꎬ采集顶部两三片叶ꎬ液氮速
试 验 材 料 为 ‘ ＺＨＣ１ ’ ( 不 耐 涝 朝 天 椒 )、
冻后于－８０ ℃ 中保存ꎮ 通过 ＣＴＡＢ 法进行 ＤＮＡ 提
‘ＺＨＣ２’ ( 耐 涝 朝 天 椒) 和 ‘ 大 方 皱 椒’ ( 线 椒)ꎮ
‘ＺＨＣ１’和‘ＺＨＣ２’为遵义市农业科学院惠赠的纯 取ꎬ用于引物的有效性筛选ꎮ ＰＣＲ 反应体系与反
系材料ꎬ‘大方皱椒’ 为贵州当地种植的常规辣椒 应程序见表 １ꎬＰＣＲ 反应在 Ｔ１００ ＴＭ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ
品种ꎮ ＰＣＲ 仪(ＢＩＯ￣ＲＡＤ 公司)上进行ꎮ
