Page 16 - 《广西植物》2023年第7期

１ １ ８ ４ 广 西 植 物 ４３ 卷
这样的生境下ꎬ野生越南槐依然能健康发芽生长 ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ)、 黑 斑 病 菌 ( Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｐａｎａｘ)ꎮ 以
并形成独特的药性ꎬ此外ꎬ项目组前期研究工作发 上菌株均保藏在广西科技大学基础医学部ꎮ
现越南槐各组织内有内生真菌( 姚裕群ꎬ２０１７)ꎮ １.１.３ 培养基、试剂与测序 马铃薯葡萄糖( ＰＤＡ)
因此ꎬ我们推测独特复杂的野外生境容易使越南 培养基、玉米培养基、ＬＡ 培养基均购自广东环凯
槐根、茎和种子形成独特而多样性的有益内生真 微生物科技有限公司ꎬ所有培养基在 １２１ ℃ ꎬ１ ×
菌组ꎬ这些内生真菌组在拮抗病虫害方面可能发 １０ Ｐａ 下湿热灭菌 ２０ ｍｉｎ 备用ꎻ次氯酸钠、甘油、
５
挥重要作用ꎮ 本研究以相同生长年限不同时期采 酒精ꎬ 均 购 自 成 都 金 山 化 学 试 剂 有 限 公 司ꎻ
集的野生越南槐根、茎和种子为研究对象ꎬ依托广 ２ｘＴａｇＭａｓｔｅｒＭｉｘꎬ购自天根生化科技有限公司ꎻ引

西科技大学重点实验室、柳州市农业气象试验站ꎬ 物 ＩＴＳ１ / ＩＴＳ４ 合成及 ＰＣＲ 产物测序均由南京钟鼎
采用组织块法分离内生真菌ꎬ 结合形态和 ＩＴＳ 序 生物技术有限公司完成ꎮ
列测序比对鉴定真菌ꎬ最大似然法构建内生真菌 １.１.４ 仪器与设备 生 物 安 全 柜 ( Ｔｈｅｒｍｏ１３７６)、
组系统发育树ꎬＲ 软件计算内生真菌组的 α￣多样 ＰＣＲ 扩 增 仪 ( ＢＩＯ￣ＲＡＤ Ｃ１０００)、 凝 胶 成 像 系 统
性指数、β￣多样性指数ꎬ分别采用琼脂块法和平板 (Ｂｉｏ￣Ｂｅｓｔ ２００Ｅ)、生化培养箱( ＳＰＸ￣２５０)、超低温
对峙法体外测定内生真菌组各分类单元对病原细 冰箱(Ｔｈｅｒｍｏ ９０２)、离心机( Ｓｉｇｍａ ３Ｋ１５)、显微镜
菌、真菌的拮抗活性ꎮ 通过分析野生越南槐根、茎 (Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３)、鼓风干燥箱( ＤＨＧ￣９０３０)、全自
和种子内生真菌组的属种系统发育、α￣多样性、β￣ 动高压灭菌锅(Ｔｏｍｙ ＸＳ５００)ꎮ
多样性及体外抗病原菌功能ꎬ拟探讨以下问题: １.２ 方法
(１)野生越南槐根、茎和种子各有益内生真菌组在 １.２.１ 根、茎和种子内生真菌的分离纯化 将越南
属种系统发育上是否有差异ꎻ(２) 野生越南槐根、 槐的新鲜健康根段、茎段和种子用流水彻底冲洗
茎和种子各有益内生真菌组的多样性和相似性如 表面ꎬ晾干后移到超净工作台分别进行表面消毒ꎬ
何ꎻ(３)野生越南槐根、茎和种子各有益内生真菌 即 ７５％酒精 １ ｍｉｎꎬ无菌水漂洗 ３ 次ꎬ５％次氯酸钠
组体外是否具有抗病功能ꎮ 本研究结果拟为探索 １ ~ ６ ｍｉｎ( 根段 / 茎段ꎬ１ ~ ２ ｍｉｎꎻ 种子ꎬ５ ~ ６ ｍｉｎ)
利用野生越南槐各有益真菌组防治栽培越南槐各 后ꎬ无菌水漂洗 ３ 次ꎬ无菌吸水纸吸干表面ꎬ根段 /
组织病害提供材料及实验基础ꎮ 茎段分别去除两端和表皮后切成 １ ｃｍ × ０.５ ｃｍ 大
小的组织块ꎬ种子分为种皮和胚ꎬ均转接至 １ / ２ 玉
１ 材料与方法 米粉培养基(含氯霉素和氨苄青霉素)ꎬ并于 ２５ ℃

培养箱黑暗培养ꎮ 待各组织边缘长出菌丝后及时
１.１ 材料 挑取单一菌丝至 ＰＤＡ 培养基上ꎬ长出的菌落ꎬ如果
１. １. １ 供 试 药 用 植 物 供 试 ８ 株 野 生 越 南 槐 外部形态不一致ꎬ继续挑取单一菌丝直至长出外
(Ｓｏｐｈｏｒａ ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ)ꎬ４ 年生ꎬ株高约 ２ ｍꎬ根直径 部形态一致的菌落ꎮ
约 １ ｃｍꎬ 茎直径约 １.５ ｃｍꎬ种子大小均匀饱满约 １.２.２ 根、茎和种子内生真菌的分类鉴定 根据菌
(０.５ ｃｍ × ０.３ ｃｍ ~ １ ｃｍ × ０.８ ｃｍꎬ根茎采集期分 落的组织来源、培养时间及外部形态ꎬ分别将根
别为 ２０２０ 年 ３ 月、８ 月、１１ 月ꎬ不同成熟度种子采 段、茎段和种子分离到的菌株划分为不同的形态
集期分别为 ２０２０ 年 ７ 月、８ 月、９ 月ꎬ均采自靖西 型ꎬ采用 ＤＮＡ 分子标记鉴定每个形态型的代表菌
市诚良村山上(１０６°２５′２６″ Ｅ、２３°０８′４９″ Ｎ)ꎮ 采 株ꎮ 采用通用引物对 ＩＴＳ１ / ＩＴＳ４ꎬ从代表菌株基因
集的越南槐根、茎和种子ꎬ分别装袋、贴上标签并 组 ＤＮＡ 扩 增 ＩＴＳ 序 列 并 测 序 ( ＩＴＳ１￣５. ８Ｓ ｒＤＮＡ￣
立即运往广西科技大学生物化学与分子生物学实 ＩＴＳ２)ꎮ 分 别 使 用 软 件 ＣｌｕｓｔａｌＸ １. ８１ 和 ＢｉｏＥｄｉｔ

验室ꎬ并在 ２４ ｈ 内处理样品ꎮ ｖ７.０ 分析测序序列ꎬ登录 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库比对ꎬ下
１.１.２ 供试病原菌 供试病原细菌为细菌性软腐 载最相似( 尽量选择正式发表) 序列ꎬ使用 ＭＥＧＡ
病菌(Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ)、细菌性条斑病菌 ６.０ 软件的邻接法( ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ) 构建系统发育
(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ)、细菌性溃疡病 树ꎬ经 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ １ ０００ 次循环检验系统树的可靠
菌(Ｘ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃｉｔｒｉ)ꎻ供试病原真菌为根腐病 性ꎮ 在系统发育树中ꎬ比对测序序列与参考序列
菌 ( Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ )、 炭 疽 病 菌 ( Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｅｈｕｍ 之间的相似性ꎬ依据真菌鉴定的常用相关阈值鉴