Page 31 - 《广西植物》2024年第12期
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１２ 期 许金港等: 水稻 ＯＣＰＩ２ 基因的克隆与表达分析 ２ １ ８ ９
究方向ꎮ 譬如ꎬ丝氨酸蛋白酶抑制剂在水稻抵御 (‘ＴＮ１’) 为 试 验 材 料ꎬ ‘ ＺＨ１１’ 用 于 试 验 处 理ꎬ
二 化 螟 ( Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ )、 稻 纵 卷 叶 螟 ‘ＴＮ１’用于饲养褐飞虱ꎮ 将颗粒饱满的水稻种子
( Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ ) 及 稻 瘟 病 菌 浸泡于清水中ꎬ置于 ３７ ℃ 恒温箱ꎮ 待浸泡种子露
(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ)等病虫害中发挥了重要作用 白后ꎬ将其以浸湿毛巾包裹ꎬ并继续置于 ３７ ℃ 恒
(Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ꎻ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１ꎻ 张 娜 等ꎬ 温箱中ꎬ待其根和芽露出后种植于灭菌营养土中ꎮ
２０２２)ꎮ 转基因水稻超量表达胰蛋白酶抑制剂基 培养条件:温度(３０ ± ２) ℃ 、光周期 １６ Ｌ( 光) ∶ ８
因 ＡｖｒＰｉｚ￣ｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４ (ＡＰＩＰ４)可增强对二 Ｄ(暗)、相对湿度(７５ ± １０)％ꎬ生长至 ４０ ｄꎬ取长
化螟和稻瘟病菌的抗性(Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ꎻ Ｌｉｕ ｅｔ 势及状态相似的水稻植株用于试验ꎮ
ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ 也有研究显示转入外源蛋白酶抑制 １.２ 供试昆虫
剂基因可增强植物对病虫害抗性ꎬ如豇豆胰蛋白 二化螟和褐飞虱用于本试验ꎮ 二化螟采用茭
酶抑制剂基因( ｃｏｗｐｅａ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒꎬ ＣｐＴＩ) 是一 白饲养至化蛹ꎬ羽化后饲以 ２０％ 的蜂蜜水ꎮ 饲养
种广谱抗虫基因ꎬ向水稻中转入 ＣｐＴＩ 基因可对多 条件:温度(２８ ± ２) ℃ 、光周期 １６ Ｌ ∶ ８ Ｄ、相对湿
种水稻害虫产生较强的抗性( Ｘｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９６)ꎮ 度(７５ ± １０)％ꎮ 褐飞虱以 ４０ ｄ 左右‘ ＴＮ１’ 水稻
转基因水稻表达大麦胰蛋白酶抑制剂 ＣＭｅ 基因显 苗饲 养ꎬ 饲 养 条 件: 温 度 ( ２６ ± ２ ) ℃ 、 光 周 期
著提高了对米象( Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ) 的抗性ꎬ进一步 １６ Ｌ ∶ ８ Ｄ、相对湿度(６０ ± １０)％ꎮ
研究发现ꎬ转基因水稻中表达的胰蛋白酶抑制剂 １.３ 水稻处理
ＣＭｅ 降低了米象肠道胰蛋白酶的活性ꎬ从而抑制 １.３.１ 二化螟为害处理 采用透明塑料筒(直径为
米象的 生 长 和 发 育 ( Ａｌｆｏｎｓｏ￣Ｒｕｂí ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３)ꎮ １.５ ｃｍꎬ高为 ７ ｃｍ)套在水稻茎秆基部ꎬ上下用海绵
因此ꎬ发掘新的蛋白酶抑制剂基因对于水稻害虫 封住后置于培养箱中放置 ３ ｄꎬ消除套管对水稻造成
绿色防控具有重要价值ꎮ 的机械损伤ꎮ 将提前饥饿处理 ２ ｈ 的 ３ 龄二化螟幼
前期转录组测序结果表明ꎬ二化螟和褐飞虱 虫接入透明管内的水稻茎秆上ꎬ并观察幼虫钻蛀行
(Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ) 为害均可诱导水稻蛋白酶抑 为ꎬ至二化螟幼虫身体一半钻入水稻茎秆后开始计
制剂基因(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ 时ꎮ 在二化螟为害水稻不同时间(０、１、２、４、８、１２、
２ꎬ ＯＣＰＩ２)上调表达ꎬ推测该基因在水稻抵御上述 ２４、４８ ｈ)后ꎬ剪取虫害部位水稻茎秆ꎬ立即浸入液氮
害虫中发挥了重要作用( Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ꎬ２０２１)ꎮ 速冻ꎬ然后置于-８０ ℃ 超低温冰箱中保存ꎮ 以套筒
本研 究 以 水 稻 品 种 ‘ 中 花 １１’ (‘ Ｚｈｏｎｇｈｕａ １１’ꎬ 后未接虫的‘ＺＨ１１’水稻相同部位茎秆作为对照ꎬ每
‘ＺＨ１１’)为材料ꎬ通过基因克隆的方法对 ＯＣＰＩ２ 个处理设置 ３ 次生物学重复ꎮ
基因编码区进行克隆ꎬ利用生物信息学软件对该 １.３.２ 褐飞虱为害处理 提前 ３ ｄ 在水稻植株基部
基因进 行 生 物 信 息 学 分 析ꎬ 通 过 实 时 荧 光 定 量 套上透明塑料筒( 见 １.３.１)ꎬ在筒内接入 １５ 头褐
ＰＣＲ 技术分析了 ＯＣＰＩ２ 基因的诱导表达特征ꎬ拟 飞虱 ４ 龄若虫ꎬ放入后开始计时ꎮ 在褐飞虱为害
探讨以下问题:(１)ＯＣＰＩ２ 基因编码区序列及其在 不同时间(０、１、２、４、８、１２、２４、４８ ｈ) 后ꎬ剪取为害
不同水稻品种中序列是否一致ꎻ(２) ＯＣＰＩ２ 基因编 部位 水 稻 茎 秆ꎬ 立 即 浸 入 液 氮 速 冻ꎬ 然 后 置 于
码蛋白的理化性质、结构特征、所属家族以及物种 －８０ ℃ 超低温冰箱中保存ꎮ 以套筒后未接入褐飞
间蛋白序列同源性和进化关系ꎻ(３) ＯＣＰＩ２ 基因在 虱的‘ＺＨ１１’水稻相同部位茎秆作为对照ꎬ每个处
不同昆虫( 二化螟和褐飞虱)、机械损伤处理和不 理设置 ３ 次生物学重复ꎮ
同植物激素(水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯) 处理后的 １.３.３ 机械损伤处理 在靠近水稻茎秆基部 ２ ~ ３
表达特征ꎬ以期为深入解析 ＯＣＰＩ２ 在水稻抗虫中 ｃｍ 处的两侧ꎬ用昆虫针( 针尖直径 ０.３２ ｍｍ) 少力
的功能奠定基础ꎮ 均匀地刺 １００ 次ꎮ 在损伤后不同时间点(０、１、２、
４、８、１２、２４、４８ ｈ)ꎬ剪取水稻损伤部位茎秆ꎬ立即
１ 材料与方法 浸入液氮速冻ꎬ然后置于-８０ ℃ 超低温冰箱中保
存ꎮ 以相同条件下未经昆虫针刺的‘ ＺＨ１１’ 水稻
１.１ 供试水稻 相同部位茎秆作为对照ꎬ每个处理设置 ３ 次生物
本研究 以 水 稻 品 种 ‘ ＺＨ１１’ 和 ‘ 台 中 １ 号’ 学重复ꎮ
