Page 33 - 《广西植物》2024年第12期

１２ 期 许金港等: 水稻 ＯＣＰＩ２ 基因的克隆与表达分析 ２ １ ９ １

ｃＤＮＡ 模板ꎬ０. ４ μＬ 的引物( 混合) 和 ２. ６ μＬ 的 度为 ２１９ ｂｐꎮ 与 ＲＧＡＰ 数 据 库 中 ‘ 日 本 晴’ 的
ｄｄＨ Ｏꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ 扩增 程 序:９５ ℃ 预 ＯＣＰＩ２ 基因( ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４２８６０) ＣＤＳ 序列进行比
２
变性 ６０ ｓꎻ９５ ℃ 变性 １０ ｓꎬ６０ ℃ 退火 ６０ ｓꎬ４０ 个 对分析ꎬ结果表明‘ＺＨ１１’ 与‘ 日本晴’ ＯＣＰＩ２ 基因
循 环ꎮ 以 水 稻 １８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ( Ｏｓ１８ｓꎬ 的 ＣＤＳ 序列完全一致(图 ２)ꎮ
ＡＫ０５９７８３) 基因作为内参ꎬ目标基因相对表达量 利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 对 ＯＣＰＩ２ 基因编码氨基酸序

－△△Ｃｔ
采用 ２ 法进行计算ꎮ 列进行分析ꎬ发现 ＯＣＰＩ２ 基因编码 ７２ 个氨基酸ꎬ
１.８ 数据处理与分析 预测蛋白分子量为 ７.７２ ｋＤａꎬ理论等电点为 ５.２１ꎮ
采 用 Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ 检 验 ( Ｓｔｕｄｅｎｔ’ ｓ ｔ￣ｔｅｓｔ) 分 析 通过 ＳｉｇｎａｌＰ ５.０ 预测分析 ＯＣＰＩ２ 氨基酸序列ꎬ发
ＯＣＰＩ２ 在害虫为害、机械损伤以及激素处理响应 现不含有信号肽( 图 ３:Ａ)ꎬ说明 ＯＣＰＩ２ 可能为非
下的表达量ꎮ 所有数据均采用 ＳＰＳＳ ２２.０ 软件进 分泌型蛋白ꎻ运用在线软件 ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ２.０ 对

行统计分析ꎮ ＯＣＰＩ２ 编码蛋白的跨膜结构进行预测分析ꎬ结果
显示 该 蛋 白 不 存 在 跨 膜 结 构 ( 图 ３: Ｂ)ꎮ 利 用
２ 结果与分析 ＮＣＢＩ 网站保守结构域分析工具对 ＯＣＰＩ２ 基因编
码氨基酸进行保守结构域分析ꎬ发现其具有一个
２.１ 水稻 ＯＣＰＩ２ 基因的克隆与分析 ｐｏｔａｔｏ＿ｉｎｈｉｂｉｔ 保守结构域(图 ３:Ｃ)ꎬ通过查询保守
以二化螟幼虫为害 ２４ ｈ 的‘ ＺＨ１１’ 水稻茎秆 结构域数据库和相关文献发现该基因属于丝氨酸
ｃＤＮＡ 为模板ꎬ利用 ＯＣＰＩ２ 基因特异性引物进行 蛋白酶抑制剂家族成员( Ｖｏｌｐｉｃｅｌｌａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１ꎻ
ＰＣＲ 扩增ꎮ 将得到的 ＰＣＲ 产物进行琼脂糖凝胶 Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２３)ꎮ
电泳检测ꎬ结果显示在 ３００ ~ ４００ ｂｐ 处出现扩增条 ２.２ ＯＣＰＩ２ 的同源性及系统发育分析
带(图 １)ꎮ 为了探究 ＯＣＰＩ２ 蛋白的进化关系ꎬ将 ８ 种禾
本科植物 ＣＰＩ 蛋白与 ＯＣＰＩ２ 蛋白进行同源性分析
及 系 统 发 育 树 构 建ꎬ 包 括 柳 枝 稷 ( Ｐａｎｉｃｕｍ
ｖｉｒｇａｔｕｍꎬ ＸＰ＿０３９８３６２７６.１)、硬直黑麦草( Ｌｏｌｉｕｍ
ｒｉｇｉｄｕｍꎬ ＸＰ ＿ ０４７０７０６４１. １)、 二 粒 小 麦 ( Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓꎬ ＸＰ ＿ ０３７４７１０６９. １ )、 乌 拉 尔 图 小 麦
( Ｔ. ｕｒａｒｔｕꎬ ＥＭＳ６１６１３. １ )、 非 洲 栽 培 稻 ( Ｏｒｙｚａ
ｇｌａｂｅｒｒｉｍａꎬ ＸＰ ＿ ０５２１３９２７２. １ )、 黑 麦 草 ( Ｌｏｌｉｕｍ
ｐｅｒｅｎｎｅꎬ ＸＰ＿０５１２２４２５１.１)、玉米( Ｚｅａ ｍａｙｓꎬ ＮＰ ＿
００１２３２８１４. ２ )、 南 荻 ( Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｌｕｔａｒｉｏｒｉｐａｒｉｕｓꎬ
ＣＡＤ６３３４９３６.１)ꎬ利用 Ｊａｌｖｉｅｗ 和 ＭＥＧＡ １１ 软件作
图ꎮ 结果表明ꎬ在 ９ 个物种中均含有一个 ｐｏｔａｔｏ＿
ｉｎｈｉｂｉｔ 保守结构域且 ＣＰＩ 蛋白在不同物种之间同

源性较 高 ( 图 ４: Ａ)ꎻ 系 统 发 育 分 析 结 果 显 示ꎬ
ＯＣＰＩ２ 蛋白与乌拉尔图小麦、硬直黑麦草、二粒小
麦和黑麦草的同源蛋白亲缘关系较近ꎬ与玉米、非
洲栽培稻、柳枝稷和南荻的亲缘关系相对较远( 图
图 １ 水稻 ＯＣＰＩ２ 基因 ＰＣＲ 扩增 ４:Ｂ)ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＯＣＰＩ２ ｏｆ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ２.３ ＯＣＰＩ２ 基因受虫害诱导的表达分析
为探究植食性昆虫为害对 ＯＣＰＩ２ 表 达 的 影
将纯化的 ＰＣＲ 产物连接至 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体ꎬ并 响ꎬ通过实时荧光定量 ＰＣＲ 技术分析 ＯＣＰＩ２ 受二
转化大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞ꎬ挑取阳性克隆 化螟和褐飞虱取食为害诱导情况ꎮ 单头 ３ 龄二化
进行测序ꎮ 测序结果表明ꎬＰＣＲ 扩增序列长度为 螟幼虫为害水稻后的 ２４ ｈ 内ꎬＯＣＰＩ２ 的表达量在 ２
３４２ ｂｐꎬ其中包含 ＯＣＰＩ２ 基因的完整 ＣＤＳ 序列ꎬ长 ｈ 和 ８ ｈ 有两个高峰期ꎬ与对照均存在显著差异ꎬ