Page 32 - 《广西植物》2024年第12期
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２ １ ９ ０ 广 西 植 物 ４４ 卷
１.３.４ 植物激素处理 使用 ｐＨ ＝ ８.０ 的 ５０ ｍｍｏｌ 上进行电泳检测ꎬ经切胶回收后连接于 ｐＭＤ￣１８Ｔ
Ｌ 磷酸缓冲液将水杨酸甲酯( 美国 Ｓｉｇｍａ 公司) 和 载体(ＴａＫａＲａ)ꎬ连接产物转入感受态大肠杆菌ꎬ并
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茉莉酸甲酯(美国 Ｓｉｇｍａ 公司) 分别配制成终浓度 涂布到含有氨苄青霉素( Ａｍｐ) 的抗性平板上培养
为 ７０ μｇｍＬ 和 １００ μｇｍＬ 的溶液ꎬ喷洒前分 过夜ꎬ挑取单菌落进行菌液 ＰＣＲ 验证ꎬ最后将 ＰＣＲ
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别加入终体积为 ０.０１％的吐温 ２０ꎮ 在 ４０ ｄ 苗龄的 验证正确的菌液送至武汉禾泰青生物公司测序ꎮ
‘ＺＨ１１’水稻整株均匀喷洒 ２ ｍＬ 上述水杨酸甲酯 利用 Ｊａｌｖｉｅｗ 软件将测序结果与‘ 日本晴’ ＯＣＰＩ２
或者茉莉酸甲酯溶液ꎮ 分别在处理 ０、１、２、４、８、 基因 序 列 进 行 比 对ꎮ 使 用 在 线 软 件 ＥｘＰＡＳｙ
１２、２４、４８ ｈ 后剪取水稻茎秆ꎬ立即浸入液氮速冻ꎬ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ /
然后置于-８０ ℃ 超低温冰箱中保存ꎮ 以相同条件 ｐｒｏｔｐａｒａｍ)预测 ＯＣＰＩ２ 蛋白分子量、理论等电点等
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下喷洒 ２ ｍＬ 的 ５０ ｍｍｏｌ Ｌ 磷 酸 缓 冲 液 ( ｐＨ 理化 特 性ꎬ 分 别 使 用 ＳｉｇｎａｌＰ ５. ０ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.
８.０)的水稻茎秆作为对照ꎬ每个处理设置 ３ 次生物 ｃｂｓ.ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ / ) 预 测 ＯＣＰＩ２ 蛋 白 的
学重复ꎮ 信 号 肽 和 ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ２. ０ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ.
１.４ 总 ＲＮＡ 提取及 ｃＤＮＡ 合成 ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ / )预测 ＯＣＰＩ２ 蛋白的跨膜
水稻茎秆组织采用液氮研磨处理后ꎬ取 １００ 结构ꎬ 以 及 使 用 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ
ｍｇ 样 品 用 于 提 取 总 ＲＮＡꎬ 参 照 ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ /
(ＴａＫａＲａ)说明书进行ꎮ 提取的 ＲＮＡ 经琼脂糖凝 ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)对 ＯＣＰＩ２ 蛋白进行结构域预测ꎮ
胶电 泳 检 测 确 认 无 降 解 后ꎬ 用 ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００
(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ ＵＳＡ) 检 测 其 浓 度 和 纯 表 １ 本研究所用引物信息
ＴＭ Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
度ꎮ 以 １ μｇ 总 ＲＮＡ 为模板ꎬ参照 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ
ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ ( Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ) 引物 序列(５′→３′) 用途
(ＴａＫａＲａ)试剂盒说明书合成 ｃＤＮＡꎮ 该反应采用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′→３′) Ｐｕｒｐｏｓｅ
２０ μＬ 反应体系ꎬ分两步进行:第一ꎬ去除基因组 ＯＣＰＩ２￣Ｆ ＧＣＴＴＣＡＴＴＡＡＴＴＴＧＣＴＧＴＧＡＣＣ 基因克隆
Ｇｅｎｅ
ＤＮＡꎻ第二ꎬ再反转录成 ｃＤＮＡꎮ 具体包括以下步 ＯＣＰＩ２￣Ｒ ＧＡＴＧＣＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＧＴＧＡＴＡＡＡＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ
骤ꎬ第 一 步 反 应: １ μｇ 总 ＲＮＡꎬ ２ μＬ ５ × ｇＤＮＡ ｑＯＣＰＩ２￣Ｆ ＧＣＣＡＡＧＧＣＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧ 实时荧光
定量 ＰＣＲ
Ｅｒａｓｅｒ Ｂｕｆｆｅｒꎬ １ μＬ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒꎬ 加 ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｑＯＣＰＩ２￣Ｒ ＣＡＡＴＣＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＣＧＧ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
ｄＨ Ｏ至 １０ μＬꎮ 反应条件:４２ ℃ ꎬ ２ ｍｉｎꎬ ４ ℃ 终止
２ ｑＯｓ１８ｓ￣Ｆ ＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＴＧＴＡＣＡ
反应ꎮ 第二 步 反 应: 第 一 步 反 应 液 １０ μＬꎬ１ μＬ ｑＯｓ１８ｓ￣Ｒ ＡＣＡＣＴＴＣＡＣＣＧＧＡＣＣＡＴＴＣＡＡ
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ Ｉꎬ１ μＬ ＲＴ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘꎬ
４ μＬ ５ × ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ２ ( ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ)ꎬ加
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ Ｏ 至总体积 ２０ μＬꎮ 反应条件:３７ １.６ 同源序列比对和系统发育分析
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℃ １５ ｍｉｎꎬ８５ ℃ ５０ ｓ 终止反应ꎮ 试验全程在超净 利用 ＮＣＢＩ 数据库 Ｂｌａｓｔｐ 工具获取其他禾本
工作台上完成ꎬ使用耗材均为 ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅꎬ反应液 科植物同源基因氨基酸序列ꎬ分别使用 Ｊａｌｖｉｅｗ 和
的配置均在冰上完成ꎬ合成的 ｃＤＮＡ 保存于-２０ ℃ ＭＥＧＡ １１ 软件进行同源序列比对和系统发育树构
冰箱用于后续试验ꎮ 建ꎬ系统发育树构建采用邻接法( Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇꎬ
１.５ 水稻 ＯＣＰＩ２ 基因克隆与序列分析 ＮＪ)ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ 值设置为 １ ０００ 次ꎮ
根 据 水 稻 基 因 组 数 据 库 ( Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ １.７ 实时荧光定量 ＰＣＲ
Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｊｅｃｔꎬ ＲＧＡＰ)报道的‘日本晴’ ( Ｏｒｙｚａ 利用 ＣＦＸ９６ 型实时荧光定量 ＰＣＲ 仪( 美国
ｓａｔｉｖａ ｓｐｐ. ｊａｐｏｎｉｃａ ) ＯＣＰＩ２ 基 因 ( ＬＯＣ ＿ 伯乐公司) 检测 ＯＣＰＩ２ 在不同处理下的表达ꎮ 采
Ｏｓ０１ｇ４２８６０)序列ꎬ用 Ｐｒｉｍｅｒ ５ 软件设计包含该基 用 Ｐｒｉｍｅｒ ５ 软件设计 ＯＣＰＩ２ 基因特异性定量引
因全部 ＣＤＳ 的上下游引物ꎬ引物序列见表 １ꎬ送至 物ꎬ引物序列见表 １ꎬ送至生工生物工程( 上海)
生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎮ 以二化 股份 有 限 公 司 合 成ꎮ 参 照 ２Ｘ Ｍ５ ＨｉＰｅｒ ＳＹＢＲ
螟幼虫为害 ２４ ｈ 的‘ ＺＨ１１’ 水稻茎秆 ｃＤＮＡ 为模 Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｓ Ｔａｑ ( 聚 合 美) 说 明 书ꎬ 选 择 １０ μＬ 的
板进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ将扩增产物在 １％的琼脂糖凝胶 ＰＣＲ 反 应 体 系ꎬ 包 括 ５ μＬ 的 ＳＹＢＲꎬ ２ μＬ 的
