Page 103 - 《广西植物》2024年第2期

２ 期 李慧敏等: 地黄氧－酰基转移酶 ＷＳＤ 基因的鉴定与表达分析 ３ ０ ５

浇 １ 次水ꎬ生长 ４ 周后ꎬ挑取长势一致的幼苗进行
１ 材料与方法 处理ꎻ用 ４０ ｍｍｏｌＬ 镉水溶液浇地黄幼苗( ＣＴ)ꎬ
￣１
用同样体积的水浇同样数量的地黄幼苗( ＣＫ)ꎬ两
１.１ 材料 组均设置 ３ 个重复ꎻ处理 １２ ｈ 后ꎬ分别取 ＣＴ 与 ＣＫ

地黄“金九”品种全长转录组测序数据(ｈｔｔｐｓ:/ / 的根、茎和叶ꎬ洗净ꎬ晾干ꎬ液氮速冻ꎬ于 － ８０ ℃ 冰
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ ｂｉｏｐｒｏｊｅｃｔ/ ＰＲＪＮＡ７８０２３３)的基 箱中保存备用(袁萍ꎬ２０２３)ꎮ
因注释表与 ＣＤＳ 表ꎻ河南师范大学生命科学学院 １. ２. ４ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 技 术 检 测 基 因 表 达 根 据
气候室中培养的盆栽“金九” 地黄植株ꎮ 其光照周 ＲｇＯＡＴＷＳＤ１ 与 ＲｇＯＡＴＷＳＤ２ 基因的碱基序列ꎬ用

期为每天 １６ ｈ 光ꎬ８ ｈ 暗ꎬ培养温度为(２６±２)℃ ꎬ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 设 计 其 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 的 引 物: ( １)
光照强度为 ２ ０００ ｌｘꎮ ＲｇＯＡＴＷＳＤ１ 基因的正向引物为 Ｆ(５′￣ＡＧＣＧＡＧＴＴ
１.２ 方法 ＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣ￣３′)ꎬ反向引物为 Ｒ(５′￣ＧＴＴＧＣＣＣＣ

１.２.１ 氧－酰基转移酶 ＷＳＤ 基因家族成员获取 ＡＣＴＧＡＣＴＴＣＣＡ￣３′)ꎮ (２) ＲｇＯＡＴＷＳＤ２ 基因的正向
打开上述基因注释表文件ꎬ点击查找ꎬ输入 Ｗａｘ 引物为 Ｆ(５′￣ＴＧＡＴＡＡＧＴＣＧＣＣＧＡＴＴＡＧＧＴＣ￣３′)ꎬ反
ｅｓｔｅｒ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＷＳ 或 ＷＳＤꎬ点击全部查找ꎬ出现目 向引物 Ｒ(５′￣ＣＴＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＧＡＴＧＴＧＣＴ￣３′)ꎮ 这
标酶及其对应的基因名ꎮ 利用其基因名在上述 些引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成ꎻ按
ＣＤＳ 表中查找其基因及其大小与碱基序列ꎬ命名 照我们 前 期 研 究 中 提 取 地 黄 的 总 ＲＮＡ 方 法 与
为 ＲｇＯＡＴＷＳＤ 基因ꎮ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 技术ꎬ以地黄基因 ＴＩＰ４１ 为内参基因ꎬ用
１.２.２ ＲｇＯＡＴＷＳＤ 基因的生物信息学分析 利用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检测两基因在 ＣＴ 与 ＣＫ 的根、茎、叶中
－ΔΔＣｔ
ＮＣＢＩ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｈｏｍｅ / 的表达水平ꎬ用 ２ 法计算其表达量( Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ
ａｎａｌｙｚｅ / )中的 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 进行氨基酸序列的推导ꎬ ２０２２)ꎮ
并利用 Ｂｌａｓｔｎ 工具查找与 ＲｇＯＡＴＷＳＤ 蛋白同源性
较高的序列ꎻ运用软件 ＤＮＡＭＡＮ ６.０ 进行氨基酸的 ２ 结果与分析
多重序列比对ꎻ利用 ＭＥＧＡ ６.０ 软件构建系统进化
树ꎻ利用 ＥｘＰＡＳｙ￣ＰｒｏｔＰａｒｍ 在线分析软件(ｈｔｔｐｓ:/ / ２.１ ＲｇＯＡＴＷＳＤ 基因家族的鉴定
ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ/ )预测 ＲｇＯＡＴＷＳＤ 蛋白的 在上 述 基 因 注 释 结 果 表 中 查 到 Ｗａｘ ｅｓｔｅｒ
理化性质ꎻ通过在线网址 ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｓｙｎｔｈａｓｅ￣ｌｉｋｅ Ａｃｙｌ￣ＣｏＡ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｄｏｍａｉｎ 或 Ｏ￣
ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ.ｈｇｃ.ｊｐ / )对 ＲｇＯＡＴＷＳＤ 蛋白进行亚细胞定 ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＷＳＤ１ ( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ) 与 Ｏ￣
位预测ꎻ利用 ＴＭＨＭＭ ２.０ 进行跨膜结构域的分析ꎻ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＷＳＤ１￣ｌｉｋｅ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ２ [ Ｓｅｓａｍｕｍ
通过 ＮＣＢＩ 的 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｎｍａｉｎ Ｓｅａｒｃｈ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｉｎｄｉｃｕｍ]ꎬ以及基因 Ｆ０１＿ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ＿１３３４２ 和 Ｆ０１＿
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ / ｗｒｐｓｂ. ｃｇｉ) 对 ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ＿１６４１９ꎬ在 ＣＤＳ 表中查到两个基因大小
其保守结构域进行在线分析ꎻ利用 ＳｉｇｎａｌＰ (ｈｔｔｐ:/ / 分别为 １ ３９２ ｂｐ 和 １ ４２２ ｂｐꎬ其碱基序列如图 １ 所
ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ / ) 进 行 信 号 肽 预 示ꎬ 并 将 其 分 别 命 名 为 ＲｇＯＡＴＷＳＤ１ 和

测ꎻ利 用 ＮｅｔＮＧｌｙｃ １. ０ ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ＲｇＯＡＴＷＳＤ２ꎬ统称 ＲｇＯＡＴＷＳＤ 基因ꎮ
ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＮｅｔＮＧｌｙｃ / )进行 Ｎ￣糖基化位点预测ꎻ利用 ２.２ ＲｇＯＡＴＷＳＤ 氨基酸序列的推导、同源性比对

ＮｅｔＰｈｏｓ ２. ０ ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ 以及系统进化分析
ＮｅｔＰｈｏｓ/ ) 进 行 磷 酸 化 位 点 预 测ꎻ 通 过 ＳＯＰＭＡ 根据 ＲｇＯＡＴＷＳＤ１ 和 ＲｇＯＡＴＷＳＤ２ 基因序列ꎬ
(ｈｔｔｐｓ:/ / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? 利用软件 ＤＮＡＭＡＮ ６.０ 推导出其分别编码由 ４６３
ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ)及 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ (ｈｔｔｐｓ:/ / 和 ４７３ 氨基酸残基组成的蛋白质ꎬ并将其分别命
ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ) 预测蛋白质的二级和三级 名为 ＲｇＯＡＴＷＳＤ１ 和 ＲｇＯＡＴＷＳＤ２ ( 图 １)ꎬ 统 称

结构ꎮ ＲｇＯＡＴＷＳＤ 蛋白ꎮ
１.２.３ 镉处理地黄幼苗的培养和处理 将地黄新 利用 ＤＮＡＭＡＮ ６.０ 进行氨基酸多重序列比对ꎬ
鲜块根切成 ２ ~ ３ ｃｍ 小块ꎬ种于花盆基质( 营养土 比对结果如图 ２ 所示ꎮ 由图 ２ 可知ꎬＲｇＯＡＴＷＳＤ１
与蛭石比例为 １ ∶ １.５) 中ꎬ在气候室培养ꎻ２ ~ ３ ｄ 与白花泡桐 [Ｐａｕｌｏｗｎｉａ ｆｏｒｔｕｎｅｉ (ＫＡＩ３４４８１２０.１)]、