Page 16 - 《广西植物》2024年第2期
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２ １ ８ 广 西 植 物 ４４ 卷
达受水杨酸( ＳＡ) 和 ＡＢＡ 的调控ꎬ但不受 ＭｅＪＡ 影
响( 吴 秋 菊 等ꎬ２０１５)ꎮ 这 些 已 有 的 研 究 均 表 明 １ 材料与方法
ＨＤＲ 基因在 ＭＥＰ 途径中具有重要的限制调控作
用ꎬ与植物类胡萝卜素、内酯等萜类化合物的合成 １.１ 材料
密切相关且受调控非生物胁迫响应的 ＡＢＡ、ＳＡ 等 ２ 年生马尾松实生苗和拟南芥种子ꎬ均取自南
植物激素诱导ꎬ说明其可能参与植物对非生物胁 京林业大学林木遗传育种全国重点实验室ꎮ
迫的响应(Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００８ꎻ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９ꎻ 大肠杆菌 Ｔｒｅｌｉｅｆ ＴＭ ５α 感受态细胞和 ｐＣｌｏｎｅ００７
Ｂｌｕｎｔ 载体购自北京擎科生物科技股份有限公司ꎻ根
Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９ꎻ 王毅等ꎬ ２０１５)ꎮ
癌农杆菌 ＧＶ３１０１ 感受态细胞购自上海唯地生物技
在马尾松中ꎬＭＥＰ 途径上游关键酶 １￣脱氧￣Ｄ￣
木酮糖￣５￣磷酸合成酶的编码基因 ＰｍＤＸＳ 和 １￣脱 术有限公司ꎻＰｌａｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｇｅｌ ＤＮＡ
氧￣Ｄ￣木 酮 糖￣５￣磷 酸 还 原 异 构 酶 的 编 码 基 因 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、 Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、 ＣｈａｍＱ
ＰｍＤＸＲ 已被成功克隆ꎬ并对其进行了功能和表达 ＳＹＢＲ Ｃｏｌｏｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、 ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ Ⅱ Ｏｎｅ
分析ꎮ ＤＸＲ 是 ＭＥＰ 途 径 的 第 一 个 关 键 酶ꎬ 对 Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ 购自南京诺唯赞生物科技股份有限
ＰｍＤＸＳ 基因的研究结果显示ꎬ用机械损伤、１５％渗 公司ꎻＢａｍＨ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、ＱｕｉｃｋＣｕｔ Ｂｕｆｆｅｒ 购自 Ｔａｋａｒａꎻ
透剂、Ｈ Ｏ 、乙烯利、ＭｅＪＡ、ＳＡ ６ 种非生物胁迫或 ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 和 １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
２ ２
激素处理马尾松后ꎬＰｍＤＸＳ 基因的表达量在短时 ＳｕｐｅｒＭｉｘ 购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司ꎻ
￣１ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ、Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ Ｆｏｒ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌｓ 和 ＴＡＥ
间内 均 有 所 上 调ꎻ 在 ４００ ｍｍｏｌ Ｌ ＮａＣｌ、 ８００
Ｂｕｆｆｅｒ 购自上海捷瑞生物工程有限公司ꎮ
￣１
ｍｍｏｌＬ Ｄ￣甘露醇( Ｄ￣ｍａｎｎｉｔｏｌ)、ｐＨ ５.０、ｐＨ ９.０
试验中引物合成和序列测序由南京擎科生物
等非生物胁 迫 环 境 下ꎬＴｒａｎｓＢ / ｐＥＴ２８ａ￣ＰｍＤＸＳ 重
科技股份有限公司和上海杰李生物技术有限公司
组菌生长状况显著优于对照ꎬ表明 ＰｍＤＸＳ 基因在
完成ꎮ
干旱和盐胁迫中具有正调控效应( 李荣ꎬ２０２１)ꎮ
１.２ 方法
综上结果表明ꎬＰｍＤＸＳ 基因参与非生物胁迫应答ꎬ
１.２. １ ＰｍＨＤＲ 基 因 的 克 隆 参 照 南 京 诺 唯 赞
在马尾松的逆境胁迫响应中起一定作用ꎮ ＤＸＲ 是
ＦａｓｔＰｕｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 的说明书提
®
催化 ＭＥＰ 途径第二步反应的关键限速酶ꎬ朱灵芝
取 ２ 年生马尾松总 ＲＮＡꎬ使用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ 超微
(２０２１)对 ＰｍＤＸＲ 基因的研究结果显示ꎬ相比于野
量紫外分光光度仪检测 ＲＮＡ 的浓度和纯度ꎬ并通
生型拟南芥ꎬＰｍＤＸＲ 转基因拟南芥的生长发育在
过琼脂糖凝胶电泳检测 ＲＮＡ 的完整性ꎮ 选取纯
不同浓度 ＮａＣｌ、ＳＡ、ＭｅＪＡ、Ｄ￣ｍａｎｎｉｔｏｌ 的胁迫条件
度高且完整性较好的 ＲＮＡꎬ利用反转录试剂盒 １ｓｔ
下受到的抑制较小ꎬ说明 ＰｍＤＸＲ 基因也在一定程
Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲ 将 ＲＮＡ
度上参与马尾松逆境胁迫响应ꎮ 因此ꎬ作为 ＭＥＰ
反转录为 ｃＤＮＡꎬ于－２０ ℃ 条件下保存备用ꎮ
途径的末端限速酶 ＨＤＲ 的编码基因ꎬＰｍＨＤＲ 极
根据火炬松(Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ) 同源基因序列ꎬ使用
有可能参与马尾松在干旱和盐等非生物胁迫的响 ＤＮＡＭＡＮ 软件设计 ＰｍＨＤＲ 特异性引物ꎬ 分别为
应过程ꎮ 本文将克隆马尾松 ＰｍＨＤＲ 基因序列ꎬ对
ＰｍＨＤＲ￣Ｆ(５′￣ＡＴＧＣＣＴＴＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴＴＧＣ￣３′)、
其进行生物信息学分析和组织特异性表达分析ꎬ
ＰｍＨＤＲ￣Ｒ ( ５′￣ＴＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＡＴ￣３′)ꎮ
并构建基因表达载体转化拟南芥ꎬ对比分析转基 以逆转录获得的马尾松 ｃＤＮＡ 第一链为模板进行
因拟南芥和野生型在干旱和盐胁迫条件下的生长 ＰＣＲ 反应ꎬ扩增体系总体积为 ５０ μＬꎬ包括高保真
情况ꎬ拟探讨以下问题:(１) ＰｍＨＤＲ 蛋白理化性 酶 ２０ μＬꎬ上游和下游引物各 １ μＬꎬｃＤＮＡ ２.５ μＬꎬ
质、结构、所属基因家族及物种间的进化关系ꎻ(２) ｄｄＨ Ｏ ２５. ５ μＬꎮ ＰＣＲ 反应程序:９５ ℃ 预变 性 ３
２
ＰｍＨＤＲ 基因的组织特异性表达模式ꎻ(３) ＰｍＨＤＲ ｍｉｎꎻ９５ ℃ 变性 １５ ｓꎬ６０ ℃ 退火 ４５ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 １
是否参与干旱和盐胁迫等非生物胁迫环境下的胁 ｍｉｎꎬ共 ３５ 个循环ꎻ７２ ℃ 延伸 ５ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 扩增产
迫响应ꎮ 以期为进一步阐明马尾松萜类化合物形 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 后ꎬ 使 用 Ｇｅｌ ＤＮＡ
成过程关键酶基因的潜在生物学功能提供帮助ꎬ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 产物回收试剂盒进行回收纯化ꎬ实施连
并为马尾松抗逆育种提供参考ꎮ 接克隆载体(ｐＣｌｏｎｅ００７)并转化至大肠杆菌Ｔｒｅｌｉｅｆ ＴＭ
