Page 18 - 《广西植物》2024年第2期

２ ２ ０ 广 西 植 物 ４４ 卷
ＡＴＧＣＣＴＴＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴ￣３′) 和 ＰｍＨＤＲ￣ＳａｃＩ￣Ｒ
(５′￣ＣＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＧＴＣＴＧＣＡＡＣＧＣ
ＣＴＣＣＴ￣３′)ꎮ 以马 尾 松 ｃＤＮＡ 第 一 链 为 模 板 进 行
ＰＣＲ 扩增ꎬ通过琼脂糖凝胶电泳检测产物质量和
大小ꎬ并切胶回收得到含酶切位点的 ＰｍＨＤＲ 基因

ＯＲＦ 片段ꎮ
用限 制 性 核 酸 内 切 酶 ＢａｍＨ Ⅰ 和 Ｓａｃ Ｉ 对
ｐＢＩ１２１￣ＧＵＳ 质粒进行双酶切ꎬ将酶切后的质粒切
胶回收后ꎬ与 ＰｍＨＤＲ 基因片段连接ꎬ并立即转化
Ｔｒｅｌｉｅｆ ＴＭ ５α 大肠杆菌ꎬ于含卡那霉素的 ＬＢ 固体培

养基上培养过夜ꎬ挑取单菌落进行 ＰＣＲ 阳性检测ꎬ
将阳性单克隆扩繁后送至南京擎科生物科技股份
有限公 司 进 行 测 序ꎬ 并 由 其 返 还 重 组 载 体 质 粒

ｐＢＩ１２１￣ＰｍＨＤＲꎮ
１.２.６ 遗传转化拟南芥及胁迫处理 用重组质粒
冻融法转化农杆菌ꎬ扩大培养阳性单菌落ꎬ花序侵 Ｍ 代表 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎬ １ 和 ２ 代表 ＰｍＨＤＲ 基因ꎮ
染法转化拟南芥ꎮ 收取拟南芥种子ꎬ依次用 ７５％ Ｍ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎬ １ ａｎｄ ２ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ＰｍＨＤＲ ｇｅｎｅｓ.
乙醇和 ２０％ 次 氯 酸 钠 消 毒ꎬ均 匀 播 种 在 含 有 ５０ 图 １ ＰｍＨＤＲ 中间片段电泳检测结果
ｍｇｍＬ Ｋａｎａ 抗生素的 ＭＳ 固体培养基上进行抗 Ｆｉｇ. １ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ
￣１
性筛选ꎬ将其中长势良好的拟南芥幼苗移栽至营 ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＰｍＨＤＲ
养土中继续培养ꎮ 分别采集野生型和转基因拟南
芥的叶片ꎬ液氮研磨ꎬ使用南京诺唯赞生物科技股 分别为赤松( Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ)、火炬松( Ｐ. ｔａｅｄａ)、
® 白云杉( Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ)、北美云杉( Ｐ. ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ) 和
份有限公司生产的 ＦａｓｔＰｕｒｅ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
日本落叶松( Ｌａｒｉｘ ｋａｅｍｐｆｅｒｉ)ꎬ其中赤松和火炬松
提取 基 因 组 ＤＮＡꎬ 并 以 其 为 模 板ꎬ 用 ＰｍＨＤＲ￣
ＢａｍＨＩ￣Ｆ 和 ＰｍＨＤＲ￣ＳａｃＩ￣Ｒ 做引物ꎬ进 行 ＰＣＲ 扩 的 ＩＤＳ１ 基因与 ＰｍＨＤＲ 基因序列相似度在 ９８％
增ꎬ筛 选 出 ＰｍＨＤＲ 转 基 因 拟 南 芥ꎮ 重 复 筛 选 １ 以上ꎮ
通过 ＮＣＢＩ 的 Ｂｌａｓｔｐ 在线软件对 ＰｍＨＤＲ 的氨
次ꎬ采集拟南芥种子ꎮ
￣１ 基酸序列进行比对ꎬ结果显示 ＰｍＨＤＲ 与赤松、火
分别配制含 ５０ ｍｍｏｌＬ ＮａＣｌ 和含 ５、１０、５０、
１００ ｍｍｏｌＬ Ｄ￣ｍａｎｎｉｔｏｌ 的 ＭＳ 固体培养基ꎬ将野 炬松的氨基酸序列相似度最高ꎬ在 ９７％以上ꎬ与北
￣１
生型和转基因拟南芥消毒后分别点播在培养基 美云杉、日本落叶松、银杏、川桑( Ｍｏｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ)、
上ꎬ每个培养基播种 ２０ 个种子ꎮ 培养 １０ ｄ 后ꎬ观 澳洲 坚 果 ( Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ)、 胡 桃 ( Ｊｕｇｌａｎｓ
察拟南芥发芽及生长状况ꎬ从每个培养基中挑选 ｒｅｇｉａ)、凤梨( Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ) 等物种的相似度也
１０ 个成功发芽的拟南芥ꎬ测量并记录其胚根长ꎬ使 均高于 ７８％ꎬ说明 ＨＤＲ 基因在进化过程中较为保
守ꎮ 选取与 ＰｍＨＤＲ 氨基酸序列相似度较高的几
用 ＲＳｔｕｄｉｏ 软件对根长数据进行分析ꎮ
个物种ꎬ通过 ＤＮＡＭＡＮ 软件进行氨基酸序列比对
２ 结果与分析 (图 ２)ꎬ结果发现 ＰｍＨＤＲ 的氨基酸序列与其他物
种一致ꎬ均含有 ４ 个保守的半胱氨酸残基活性位
２.１ ＰｍＨＤＲ 基因的克隆及序列比对 点ꎬＬｕ 等(２００８)研究表明这些活性位点可能参与
扩增获得 ＰｍＨＤＲ 基因中间片段序列ꎬ长度为 催化过程中铁硫键的形成ꎮ

１ ４５８ ｂｐꎬ与琼脂糖凝胶电泳结果相符(图 １)ꎮ ２.２ ＰｍＨＤＲ 的生物信息学分析
通过 ＮＣＢＩ 的 Ｂｌａｓｔｎ 在线软件ꎬ将 ＰｍＨＤＲ 基 ２.２.１ 蛋白一级结构及理化性质分析 ＰｍＨＤＲ 编
因序列与其他物种进行比对ꎮ 输出结果显示ꎬ共 码蛋白的分子式为 Ｃ ２４１５ Ｈ ３８４４ Ｎ ６５４ Ｏ ７４４ Ｓ ꎬ理论分子
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有 ５ 种植物基因序列与 ＰｍＨＤＲ 相似度高于 ８５％ꎬ 质量为 ５４.５５ ｋＤꎬ理论等电点为 ５.９８ꎬ 由 ４８５ 个氨