Page 17 - 《广西植物》2024年第2期

２ 期 王嘉雯等: 马尾松 ＨＤＲ 基因克隆及其对旱与盐胁迫的响应 ２ １ ９

表 １ 生物信息学分析在线软件及网址 １.２. ３ ＰｍＨＤＲ 同 义 密 码 子 偏 好 性 分 析 利 用
Ｔａｂｌｅ １ Ｏｎｌｉｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅｓ ａｎｄ ｗｅｂｓｉｔｅｓ ｏｆ ＣｏｄｏｎＷ １.４.２ 软件计算 ＰｍＨＤＲ 密码子的使用特
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ 性参数ꎬ包括 Ａ３ｓ、Ｕ３ｓ、Ｃ３ｓ、Ｇ３ｓ、相对同义密码子

在线软件 使用度( ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅꎬ ＲＳＣＵ)、
网址 用途
Ｏｎｌｉｎｅ
Ｗｅｂｓｉｔｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓｏｆｔｗａｒｅ 有效密码子数( ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｄｏｎｓꎬ ＥＮＣ)、
ＢＬＡＳＴ ｈｔｔｐｓ:/ / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ/ 序列比对 密码子适应系数(ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘꎬ ＣＡＩ)、最
Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
优密码 子 使 用 频 率 ( ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｄｏｎｓꎬ
ＥｘＰＡＳｙ￣ ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ ｐｒｏｔｐａｒａｍ 理化性质分析 ＦＯＰ)、 ＧＣ 含 量 和 密 码 子 第 ３ 位 上 的 ＧＣ 含 量
ＰｒｏｔＰａｒａｍ Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｐｒｏｐｅｒｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ (ＧＣ３ｓ)等ꎮ 运用 ＥＭＢＯＳＳ 中的 ＣＵＳＰ 在线软件计
ＥｘＰａｓｙ￣ ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ ｐｒｏｔｓｃａｌｅ 亲疏水性分析 算密码子的使用频率ꎮ
ＰｒｏｔＳｃａｌｅ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ 拟南芥、烟草( Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ)、大 肠 杆 菌
ＮＣＢＩ￣ＣＤ ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ/ 保守结构域分析 (Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ) 和 酿 酒 酵 母 ( Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ/ ｃｄｄ/ ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)的基因组密码子使用频率数据来自密码
ｄｏｍａｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ ２.０ ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｃｓｂｉｏ. ｓｊｔｕ. ｅｄｕ. ｃｎ/ 亚 细 胞 定 位 子使 用 统 计 数 据 库 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｋａｚｕｓａ. ｏｒ. ｊｐ /
ｂｉｏｉｎｆ/ Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ￣２ 预测
ｃｏｄｏｎ)ꎮ
Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ
１.２.４ ＰｍＨＤＲ 基因的表达分析 剪取 ２ 年生马尾
ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ
ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
松根、幼叶、老叶、幼茎、老茎 ５ 个部位的样品ꎬ分
ＳＯＰＭＡ ｈｔｔｐｓ:/ / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ 二级结构预测
ｎｐｓａ ＿ ａｕｔｏｍａｔ. ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ ＿ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ 别使用液氮研磨ꎬ提取各样品总 ＲＮＡꎬ通过琼脂糖
ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 凝胶电泳和 Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ 超微量紫外分光光度仪
ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
检测各 ＲＮＡ 的浓度和质量ꎬ将符合要求的 ＲＮＡ 反
Ｐｈｙｒｅ ２ ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｓｂｇ. ｂｉｏ. ｉｃ. ａｃ. ｕｋ/ 三级结构预测
ｐｈｙｒｅ２ Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 转录成 ｃＤＮＡꎮ 使用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ 测定 ｃＤＮＡ 浓
ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
￣１
度ꎬ并将各 ｃＤＮＡ 稀释至 １０ ｎｇμＬ ꎮ
ＴＭＨＭＭ ２.０ ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ 跨膜结构分析
ＴＭＨＭＭ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ 根据克隆所得 ＰｍＨＤＲ 基因序列ꎬ使用 Ｐｒｉｍｉｅｒ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
５.０ 软件设计实时荧光定量 ＰＣＲ( ｑＰＣＲ) 引物 ｑ￣
ＳｉｇｎａｌＰ ５.０ ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ 信号肽分析
ＰｍＨＤＲ￣Ｆ(５′￣ＡＧＡＡＡＴＣＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡ￣３′) 和 ｑ￣
ＳｉｇｎａｌＰ￣５.０ Ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ
ＰｍＨＤＲ￣Ｒ ( ５′￣ＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴ￣３′)ꎬ 以
ａｎａｌｙｓｉｓ
ＮｅｔＰｈｏｓ ３.１ ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ 磷酸化位点分析 ＴＵＡ ( ＧｅｎＢａｎｋ: ＫＭ４９６５３５. １ ) 为 内 参 基 因ꎬ 用
ＮｅｔＰｈｏｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ 进行实时荧光定量表达分析ꎮ 反应体
ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
ＹｉｎＯＹａｎｇ １.２ ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ Ｏ￣糖基 化 位 点 系共 １０ μＬꎬ包括 ｃＤＮＡ 模板 １ μＬ、上下游引物各
ＹｉｎＯＹａｎｇ 分析
Ｏ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ０. ２ μＬ、 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
(２×) ５ μＬ、 无 菌 水 ３. ６ μＬꎮ ｑＰＣＲ 反 应 在 ＡＢＩ
ＮｅｔＮＧｌｙｃ １.０ ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ Ｎ￣糖基 化 位 点 ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ 荧光定量 ＰＣＲ 仪上进行ꎬ反应程序使
ＮｅｔＮＧｌｙｃ 分析
Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ 用两步法:９５ ℃ 预变性 ３０ ｓꎻ９５ ℃ 变性 ５ ｓꎬ６０ ℃
ｓｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
退火延伸 ３０ ｓꎬ４０ 次循环ꎬ分别设置 ３ 次生物学重
复和 ３ 次技术重复ꎬＰＣＲ 反应结束后进行熔解曲
５α 感受态细胞中ꎬ培养单菌落ꎬ通过菌落 ＰＣＲ 筛 线分析ꎮ 使用 ＳＰＳＳ ２６ 软件进行数据分析并作图ꎬ
选阳 性 克 隆 送 至 南 京 擎 科 生 物 科 技 有 限 公 司 采用邓肯多重比较法分析各组织表达量差异显

测序ꎮ 著性ꎮ
１.２.２ ＰｍＨＤＲ 基因的生物信息学分析 利用在线 １.２.５ 基因表达载体构建 使用 ｐＢＩ１２１￣ＧＵＳ 质粒
软件对 ＰｍＨＤＲ 基因及其编码蛋白进行生物信息 作为真核表达载体ꎬ根据测序得到的 ＰｍＨＤＲ 基因
学分析ꎬ具体网址见表 １ꎻ利用 ＤＮＡＭＡＮ 软件对 序列ꎬ选择 ＢａｍＨ Ｉ 和 Ｓａｃ Ｉ 两个酶切位点ꎬ设计去
ＰｍＨＤＲ 蛋白进行同源性比对ꎻ运用 ＭＥＧＡ ７.０ 的 除终止密码子且含有酶切位点序列的重组引物
邻接法构建系统发育进化树ꎮ ＰｍＨＤＲ￣ＢａｍＨＩ￣Ｆ (５′￣ＡＣＧＧＧＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣ