Page 56 - 《广西植物》2024年第2期

２ ５ ８ 广 西 植 物 ４４ 卷
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＰ３ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｄｕｒｉｎｇ ｃａｌｙｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ Ｈ. ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ‘ Ｄｏｏｌｅｙ’ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ
ｍａｔｅｒｉａｌ. Ｔｈｅ ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ Ｃｌａｓｓ Ｂ ｇｅｎｅ ＨｍＡＰ３ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄꎬ ａｎｄ ｉｔｓ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｑｕｉｃｋｅｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｎｅｗ ｖａｒｉｅｔｉｅｓꎬ ｈｉｇｈｌｙ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ
ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｈ. ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｇｅｎｏｍｅ
ｂｙ ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: (１) Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＨｍＡＰ３
ｗａｓ ５４６ ｂｐꎬ ｅｎｃｏｄｉｎｇ １８１ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ. Ｉｔｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ １００％ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ５８.８％
ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ. (２) ＡＰ３ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｅｎｅｒａ. Ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｇｅｎｕｓꎬ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｏｆ ＡＰ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｄ ｏｎｌｙ ｉｎ ａ ｆｅｗ ｍｏｔｉｆｓ. ( ３) Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｔｗｏ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ
ＨｍＡＰ３. Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｗｏ ｓｉｎｇｌｅ￣ｔａｒｇｅｔ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ. (４) Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｆｉｖｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｕｄｓ ｗｉｔｈ Ｃａｓ９ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｏｍｅｓ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅ ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃａｓ９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ＡＰ３ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｗｏｒｋ ｏｆ
ｄｏｕｂｌｅ ｆｌｏｗｅｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄꎬ ａｎｄ ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ￣ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ
Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ Ｈ. ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａꎬ ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ ｆａｍｉｌｙꎬ ＡＰ３ꎬ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ꎬ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ

绣球 (Ｈｙｄｒａｎｇｅａ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ)ꎬ虎耳草科绣球 仅 应 用 于 毛 白 杨 ( Ｆａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ )、 矮 牵 牛

属ꎬ又名八仙花ꎬ在庭院景观中的应用历史悠久ꎬ (Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ꎻ Ｓｕｎ ＆ Ｋａｏꎬ ２０１８ꎻ Ｘｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ
是一种具有较高观赏价值的园林植物ꎬ作为世界 ２０２０ꎻ Ｙｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１ )、 菊 花 ( Ｋｉｓｈｉ￣Ｋａｂｏｓｈｉ ｅｔ
流行的切花深受大众喜爱ꎮ 目前绣球主要有蕾丝 ａｌ.ꎬ ２０１７)、 铁 皮 石 斛 ( Ｋｕｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)、 百 合
帽形和圆球形两类花序ꎬ其花序中的不育花具有 (Ｙａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)、牵牛花 (Ｓｈｉｂｕｙａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８ꎻ
大而艳丽的花瓣状萼片ꎬ是绣球的主要观赏组织ꎮ Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)、蓝猪耳 ( Ｎｉｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ.ꎬ
绣球不育花有单瓣和重瓣之分ꎬ其中单瓣类只有 ２０１８)与蝴蝶兰 (Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ꎻ Ｓｅｍｉａｒｔｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ
一轮观赏性萼片ꎬ重瓣类则具有多轮观赏性萼片ꎮ ２０２０) ꎮ
相比之下ꎬ重瓣绣球具有更高的观赏和经济价值ꎬ 花器官由花瓣、花萼、雄蕊和心皮 ４ 个部分组
是绣球新 品 种 培 育 的 重 要 方 向 ( Ｓｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ.ꎬ 成ꎬ其基因表达调控机制可以用 ＡＢＣＤＥ 模型来解
２０１５)ꎮ 目前ꎬ国内外的绣球育种方式以杂交育种 释ꎮ 在 ＡＢＣＤＥ 模型中ꎬＢ 类基因主要负责与 Ａ 类
为主ꎬ其育种效率低、周期长ꎬ难以适应日益增长 基因共同调控花瓣的形成ꎬ以及与 Ｃ 类基因共同调
的市场需求 (Ｗｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎬ需要探索更快捷、 控雄蕊的形成 (Ｃｏｅｎ ＆ Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚꎬ １９９１)ꎻ除 Ａ 类
高效的育种方式ꎮ 基因中的 ＡＰ２ 属于 ＡＰ２ / ＥＲＦ 家族外ꎬ该模型中的
ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 技术是一种新兴的基因编辑技 其余基 因 均 属 于 ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ 基 因 家 族 ( 王 莹 等ꎬ
术ꎬ能够定向改变植物的观赏性状ꎬ如改造花型和 ２０２１)ꎮ ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ Ｂ 类基因亚家族成员广泛存在
花色ꎬ延长观赏周期等ꎬ在园林植物新品种繁育工 于现存植物的基因组中ꎬ在裸子植物小孢子叶球与
作中具有极大的发展潜力和经济 价 值 ( Ｋａｕｒ ｅｔ 被子植物花瓣和雄蕊中均有表达ꎬ在植物发育过程
ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑系统由 Ｃａｓ９ 中具有重要地位 (Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９８)ꎮ Ｂ 类基因包
核酸酶和单引导 ＲＮＡ (ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡꎬ ｓｇＲＮＡ) 含 ＡＰＥＴＡＬＡ３ (ＡＰ３) 和 ＰＩＴＩＬＬＡＴＡ (ＰＩ) 两个谱系ꎬ
构成 (Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)ꎬ二者在植物细胞内转录 其中 ＡＰ３ 谱 系 主 要 调 控 花 瓣 和 花 萼 的 形 成
后形成复合体ꎬ识别植物基因组中的间区序列邻 (Ｊａｒａｍｉｌｌｏ ＆ Ｋｒａｍｅｒꎬ ２００４)ꎮ ＡＰ３ 蛋白中含有保守
近基序 ( ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆꎬ ＰＡＭ) 前端约 的 Ｋ￣ＢＯＸ 结构域ꎬ该结构域能够引导 ＡＰ３ 蛋白与
２０ ｎｔ 核苷酸序列并结合ꎬＣａｓ９ 核酸酶切割该序列 ＰＩ、ＳＥＰ３、ＡＰ１ 蛋白形成四聚体ꎬ诱导花瓣原基形成

形成 ＤＮＡ 双 链 缺 口 ( ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓꎬ (Ｍｅｌｚｅｒ ＆ Ｔｈｅｉßｅｎꎬ ２００９ꎻ Ｔｈｅｉßｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ
ＤＳＢｓ)ꎬ引发植物自身损伤修复机制ꎬ产生随机的 在观赏植物中ꎬ已经发现 ＡＰ３ 基因沉默能够导致矮
碱基缺失 (Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ 与其他园艺作物相 牵 牛 ( ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌꎬ １９９３ )、 兰 花 ( Ｍｏｎｄｒａｇóｎ￣
比ꎬＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 技术在园林植物中的应用较少ꎬ Ｐａｌｏｍｉｎｏ ＆ Ｔｈｅｉßｅｎꎬ ２００９)与耧斗菜 (Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ