Page 129 - 《广西植物》2025年第10期

１０ 期 张高荣等: 宽筋藤内生真菌 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ ＫＪＴ￣１ 的分离鉴定及其微生物转化研究 １ ８ ５ ９

究发现ꎬ内生真菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ￣Ｃ３９ 生物转化后的滇 公司)、生化培养箱 (购自山东博科生物产业有限
重楼中的重楼总皂苷及重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ和Ⅶ含量 公司)、移液枪 ( 购自德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司)、多功
显著提高ꎮ 宽筋藤一直作为民族药使用ꎬ目前对 能酶标仪 (购自山东博科生物产业有限公司)ꎮ
其研究主要集中在提取物及化学成分方面ꎮ 然
而ꎬ对于宽筋藤内生菌及其微生物转化的研究尚 ２ 实验方法
未报道ꎬ其是否能对宿主进行生物转化及转化前
后的物质成分及生物活性是否存在差异亦尚未清 ２.１ 宽筋藤内生真菌 ＫＪＴ￣１ 的分离纯化
楚ꎮ 因此ꎬ本研究通过对宽筋藤内生真菌进行分 内 生 真 菌 的 分 离 纯 化 操 作 参 考 谢 少 朵 等
离鉴定及其对宽筋藤药材进行微生物转化ꎬ探讨 (２０１８)的方法进行ꎮ 将新鲜的宽筋藤茎用已消毒
微生物转化前后宽筋藤的物质变化及生物活性差 的剪刀剪成断ꎬ用 ７５％的乙醇溶液进行浸泡消毒 ３
异ꎬ为进一步开发利用宽筋藤及其微生物资源提 ｍｉｎ 后取出ꎬ５％次氯酸钠溶液浸泡 ３０ ｓꎬ用无菌水

供理论依据ꎮ 进行冲洗 ４ ~ ５ 次ꎬ吸水晾干ꎮ 用已消毒灭菌的解
剖刀进行切割ꎬ分成合适的小段 (５ ｍｍ × ５ ｍｍ)ꎬ
１ 材料与方法 并将其以三角形形状均匀接种于含有氨苄青霉素
钠的 ＰＤＡ 平板培养基上ꎬ于 ２５ ~ ２８ ℃ 的生化培养
１.１ 材料 箱中培养至长出菌丝ꎮ 将最后一次冲洗的无菌水
２０２２ 年 ５ 月采自广西河池市宜州区的 １ 株新 涂布于相同处理的 ＰＤＡ 平板培养基上作为表面消
鲜宽筋藤药材ꎬ经河池学院谢彦军老师鉴定为中 毒对照ꎬ培养 ５ ~ ７ ｄ 无真菌生长即说明表面消毒
华青牛胆( Ｔｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ) 的藤茎ꎬ标本存放于 彻底ꎬ说明分离得到的真菌即为植物内生真菌ꎮ
河池学院 ２０１ 实验室ꎮ 指示菌株金黄色葡萄球菌 待接种的茎皮组织培养长出菌丝后ꎬ用已消毒的
( Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ)、 白 色 念 珠 菌 ( Ｃａｎｄｉｄａ 接种环挑取菌丝接种到新鲜 ＰＤＡ 平板培养基上ꎬ
ａｌｂｉｃａｎｓ)、绿脓杆菌 ( Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａ ｅｒｕｇｉｎｏｓａ)、大 于 ２５ ~ ２８ ℃ 培养ꎬ之后不断挑取顶端菌丝进一步
肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)、链球菌 ( Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ) 由 进行分离纯化ꎬ直至出现单一菌落为止ꎮ 挑取获
河池学院何海燕教授实验室惠赠ꎬ土豆、大米均购 得的单一菌落的顶端菌丝接种到新的 ＰＤＡ 平板培
自当地超市ꎬ宽筋藤药材购自当地药店ꎮ 养基上ꎬ即获得纯化的单一纯菌株 ＫＪＴ￣１ꎬ４ ℃ 保存
１.２ 培养基种类 备用 (谢少朵等ꎬ２０１８)ꎮ
ＰＤＡ 培养基、ＰＤＢ 培养基、ＬＢ 液体培养基、大 ２.２ 内生真菌 ＫＪＴ￣１ 的菌种鉴定
米培养基 (将 ５０ ｇ 大米置于 ５００ ｍＬ 锥形瓶中ꎬ加 挑取适量的 ＫＪＴ￣１ 菌株菌丝体接种到 ＰＤＡ 平
蒸馏水约 ８０ ｍＬ)、宽筋藤药材培养基 ( 将宽筋藤 板培养基上ꎬ观察其形态特征并记录ꎮ 挑取适量
药材进行粉碎ꎬ过 ８０ 目筛ꎬ称取 ５０ ｇ 药材粉末置 的 ＫＪＴ￣１ 菌 株 菌 丝 接 种 到 ＰＤＢ 液 体 培 养 基 中ꎬ
于 ５００ ｍＬ 锥形瓶中ꎬ加蒸馏水约 ８０ ｍＬ)ꎬ以上培 ２５ ~ ２８ ℃ 条件下摇床培养 ３ ~ ４ ｄꎬ离心ꎬ转速 １ ５００

￣１
养基均经高压蒸汽灭菌后使用ꎮ ｒｍｉｎ ꎬ收集菌丝体后用 ＤＮＡ 提取试剂盒提取其
１.３ 试剂与仪器 ＤＮＡꎮ 扩增引物为 ＩＴＳ１ (５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴ
１.３.１ 试剂 １ꎬ１￣二苯基￣２￣苦肼基 ( ＤＰＰＨ)、氨苄 ＧＣＧＧ－３′)和 ＩＴＳ４ (５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧ
青 霉 素 钠、 阿 莫 西 林、 氟 康 唑、 二 甲 基 亚 砜 Ｃ－３′)ꎬ产物纯度检测、测序等工作委托青岛鹏翔
(ＤＭＳＯ)、氯化钠、葡萄糖、磷酸二氢钾和氢氧化钠 生物科技有限公司进行ꎮ 将基因测序获得的结果
等实验试剂和药品均购自广西依玲医疗器械有限 与 ＮＣＢＩ 核 酸 数 据 库 中 的 数 据 进 行 比 对ꎬ 使 用
公司ꎬ正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、石油醚、无水乙醇 ＭＥＧＡ ７ 软件构建其系统发育树ꎬ确定其种属 ( 刘
均为分析纯试剂且购买于西陇科学股份有限公 琳玉等ꎬ２０２４)ꎮ
司ꎬ蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉和酵母粉均购自北京 ２.３ 微生物转化发酵培养
奥博星生物科技有限责任公司ꎮ 微生物转化培养基制备及发酵转化参考刘姜
１.３.２ 仪器 旋转蒸发仪 (购自上海亚荣科技有限 华(２０１８) 和邹海亮( ２０１９) 的方法进行修改ꎮ 挑
公司)、高效液相 －质谱联用仪 ( 购自美国 Ｗａｔｅｒｓ 取适量活化好的 ＫＪＴ￣１ 菌株菌丝接种至 ＰＤＢ 培养