Page 130 - 《广西植物》2025年第10期
P. 130
１ ８ ６ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
基中ꎬ２５ ~ ２８ ℃ 条件下摇床培养 ３ ｄ 得到种子发酵 ２.６ 微生物转化后宽筋藤正丁醇萃取物最小杀菌
液ꎮ 在无菌条件下ꎬ吸取已摇匀的 ５ ｍＬ 种子发酵 浓度测定
液分别接种到已灭菌放凉的 ２ 种供试培养基( 宽 以试管二倍稀释法来确 定 其 最 小 杀 菌 浓 度
筋藤药材培养基和大米培养基) 中ꎬ于 ２５ ~ ２８ ℃ (ｍｉｎｉｍｕｍ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬ ＭＢＣ) ( 李 慕
条件下发酵 ２８ ｄꎮ 同时ꎬ用 ５ ｍＬ 的无菌水代替种 紫ꎬ２０１７)ꎮ 取 １０ 支已灭菌处理的试管并分别编
子发酵液的宽筋藤药材培养基作为空白对照ꎬ其 号为 １ ~ １０ꎬ往试管中分别加入 ２ ｍＬ 的无菌肉汤
他处理过程与实验组一致ꎮ 培养基ꎮ 第 １ 管中添加以 ＤＭＳＯ 配置的浓度为 １
￣１
２.４ 微生物转化前后宽筋藤药材提取物和 ＫＪＴ￣１ ｇｍＬ 的待测样品 ２ ｍＬꎬ并充分混合ꎮ 按照梯度
菌株代谢产物制备 稀释的方法ꎬ将样品溶液从第 １ 管逐步稀释至第 ９
宽筋藤药材提取物制备参考高艳艳等(２０２２) 管ꎬ稀释后的 １ ~ ９ 管的浓度分别为 ５００、２５０、１２５、
的方法ꎮ 将未添加种子发酵液的宽筋藤药材培养 ６２.５、３１.２５、１５.６３、７.８１、３.９１、１.９５ ｍｇｍＬ ꎮ 第
￣１
基用 １ Ｌ 的 ７０％乙醇连续提取 ３ 次ꎬ每次 ２ ｈꎬ过 １０ 管则加入生理盐水ꎬ作为对照管ꎮ 接着ꎬ分别向
滤ꎬ然后将所有提取液合并ꎬ减压浓缩得到粗提物 １ ~ １０ 管中添加 ０.１ ｍＬ 的菌液ꎬ混匀ꎮ 每管设置 ３
(ＣＥ￣１)ꎮ 接着以水为溶剂来分散粗提物ꎬ依次用 个平行ꎮ 随后ꎬ将所有试管放入 ３７ ℃ 培养箱中ꎬ
１ Ｌ 的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取ꎬ最后分别 静置培养 ２０ ｈꎮ 培养结束后ꎬ在无菌条件下从每
减压浓缩得到石油醚萃取物 ( ＰＥ￣１)、乙酸乙酯萃 一支试管中取 ０.１ ｍＬ 培养液ꎬ分别置于 ＬＢ 培养
取物 (ＥＡ￣１)和正丁醇萃取物 ( ｎ￣ＢＥ￣１)ꎮ 微生物 基的培养皿上ꎬ并使用涂布器将其均匀涂覆ꎮ 将
转化后宽筋藤药材提取物制备按照上述步骤操作 培养皿置于 ３７ ℃ 培养箱中培养 ２０ ｈ 并观察记录ꎮ
进行ꎬ得到微生物转化后的宽筋藤粗提物 ( ＣＥ￣ 若某浓度下的培养皿上有菌生长ꎬ则记为“ ＋”ꎬ表
２)、油醚萃取物 (ＰＥ￣２)、乙酸乙酯萃取物 ( ＥＡ￣２) 示无杀菌效果ꎻ反之ꎬ则记为“ －”ꎬ表示有杀菌效
和正丁醇萃取物 ( ｎ￣ＢＥ￣２)ꎮ ＫＪＴ￣１ 菌株大米培养 果ꎮ 如果观察到培养皿上没有任何菌落生长ꎬ指
基发酵产物用 １ Ｌ 的 ７０％乙醇连续提取 ３ 次ꎬ每次 示药物已成功灭菌ꎬ以无菌生长对应的最低药物
２ ｈꎬ过滤ꎬ将所有提取液合并ꎬ减压浓缩得到 ＫＪＴ￣ 稀释浓度作为该样品对受试菌株的 ＭＢＣ 值ꎮ
１ 菌株代谢产物ꎮ ２.７ 微生物转化前后宽筋藤各萃取物 ＤＰＰＨ 自由
２.５ 微 生 物 转 化 前 后 宽 筋 藤 各 提 取 物 抑 菌 活 性 基清除实验
测定 ＤＰＰＨ 自由基清除实验参照王妍惠(２０２１) 的
以打孔法测定微生物转化前后宽筋藤提取物 方法进行ꎮ 将微生物转化前后宽筋藤粗提物与各
的抑菌圈直径对抑菌活性进行评价 ( 徐晓梅等ꎬ 萃取 物 ( ＣＥ￣１、 ＰＥ￣１、 ＥＡ￣１、 ｎ￣ＢＥ￣１、 ＣＥ￣２、 ＰＥ￣２、
２０１８)ꎮ 分别用 ＤＭＳＯ 将微生物转化前后的宽筋 ＥＡ￣２、ｎ￣ＢＥ￣２) 分别加入无水乙醇稀释 ２０ 倍ꎬ６０
藤各提取物 (ＣＥ￣１、ＰＥ￣１、ＥＡ￣１、ｎ￣ＢＥ￣１、ＣＥ￣２、ＰＥ￣２、 ℃ 超声处理 １０ ｍｉｎꎬ备用ꎮ 用无水乙醇将 ５０ ｍｇ
￣１
ＥＡ￣２、ｎ￣ＢＥ￣２) 配制成 １ ｇｍＬ 的样品溶液ꎬ阳性 ｍＬ 的样品稀释成 １.０、０.５、０.１、０.０５、０.０１ ｍｇ
￣１
￣１
对照药 物 氟 康 唑 和 阿 莫 西 林 浓 度 分 别 配 成 ２０ ｍＬ 的样品溶液ꎮ 维生素 Ｃ (ＶＣ) 作为阳性对照ꎮ
ｍｇｍＬ 和 ０.１ ｍｇｍＬ ꎬＫＪＴ￣１ 菌株代谢产物配 分别吸取 ３ ｍＬ 各浓度的样品溶液和阳性对照溶
￣１
￣１
置成 １ ｇｍＬ 的样品溶液做空白对照ꎮ 在无菌条 液与 ２ ｍＬ ＤＰＰＨ 溶液混合ꎬ避光反应 ３０ ｍｉｎꎮ 以
￣１
件下ꎬ将供试菌株 ( 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、 无水乙醇作为空白对照ꎬ测定 ５１７ ｎｍ 处的吸光度
白色念珠菌、链球菌、绿脓杆菌) 涂布于 ＬＢ 培养 并计算 ＤＰＰＨ 自由基清除率ꎬ其计算方法参考李
基平板上ꎬ然后等间距放置用样品溶液、空白对照 火云等 ( ２０１５ ) 和 刘 亚 男 等 ( ２０２３ )ꎬ 计 算 公 式
溶液和阳性对照溶液浸泡的 ６ ｍｍ 直径的小纸片ꎬ 如下:
每个样品设置 ３ 个重复ꎮ 随后将其培养皿放置于 æ Ａ － Ａ ö
１
２
ＤＰＰＨ 自由基清除率(％) ＝ ç １ － ÷ ×
３７ ℃ 的培养箱中培养 ２０ ｈꎮ 使用“ 十字交叉” 方 è Ａ ０ ø
法测量抑菌圈的直径ꎬ用抑菌圈直径的平均值±标 １００ꎮ
准差 ( ｘ ± ｓ) 来 评 估 其 对 ５ 种 指 示 菌 株 的 抑 制 式中: Ａ 是 ＤＰＰＨ ２ ｍＬ 和 ３ ｍＬ 的无水乙醇
０
效果ꎮ 反应后测定的吸光度ꎻＡ 是 ２ ｍＬ 无水乙醇与 ３ ｍＬ
１
