Page 189 - 《广西植物》2025年第10期

１０ 期 张晓宁等: 马尾松花粉超低温保存的生理响应及转录组分析 １ ９ １ ９

(２)差异基因 ＧＯ / ＫＥＧＧ 富集分析ꎮ 使用 ＧＯ 组测序数据质量较高ꎬ可开展后续工作ꎮ
(Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ) 和 ＫＥＧＧ ( Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ ２.３.２ 序列及基因比对结果 利用 ＨＩＳＡＴ２ 软件ꎬ将
Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ)数据库对差异表达基因进行 过滤后的 Ｒｅａｄｓ 比对到参考基因组上ꎬ８９％以上的
功能注释ꎬ根据注释结果对差异基因进行分类ꎬ再 Ｒｅａｄｓ( ３９１ ５６１ ６５１) 定位到参考基因组上ꎬ 其中
通过超几何分布方法计算 Ｐ 值ꎬ显著富集的标准 ８６％以上共 ３４０ ７５６ ９２７ 定位到外显子上ꎮ 可见样
为 Ｐ<０.０５ꎬ选取 Ｐ<０.０５ 的 ＧＯ ｔｅｒｍ 作为显著富集 品的质量和数据较为可靠ꎮ ９ 个样本有 ３８ ５０５ 个
的 ＧＯ 条目进行分析ꎮ 根据注释结果推测基因在 (４７.８４％) 基因比对到参考基因组(８０ ４９５)ꎬ其中

通路中的作用ꎮ ５８％(２２ ３３３)以上基因覆盖度在 ８０％以上ꎮ
２.３.３ 差异基因的分析 根据 ＨＩＳＡＴ２ 的比对结
２ 结果与分析 果ꎬ利用 Ｓｔｒｉｎｇｔｉｅ 重构转录本ꎬ并利用 ＲＳＥＭ 计算

每个 样 本 中 所 有 基 因 的 表 达 量ꎮ 按 照 ｜ Ｆｏｌｄ￣
２.１ 马尾松花粉超低温保存研究 Ｃｈａｎｇｅ ｜ >１ꎬＰ<０.０５ 的标准对组间基因表达量的
２.１.１ 花粉活力鉴定方法比较 如图 １ 所示ꎬ３ 种 差异做统计分析ꎮ 差异表达基因情况如图 ５ 所
方法检测花粉活力情况均较好ꎬ均在 ９０％以上ꎬ但 示ꎬＣＫ ｖｓ ＬＤ、ＣＫ ｖｓ ＨＤ、ＬＤ ｖｓ ＨＤ 差异基因数目
培养基离体萌发需要时间较长ꎬ至少要 ６ ｈ 才能统 分别为 ２３２( 上调 １００ꎬ下调 １３２)、２６８( 上调 １２２ꎬ
计结果ꎻＦＤＡ 荧光染色几乎 １００％存活ꎬ存活率较 下调 １４６)、２１８(上调 １１０ꎬ下调 １０８)ꎮ
高ꎮ ＴＴＣ 染色法准确率高ꎬ需要时间短ꎬ０.５ ｈ 即可 ２.３.４ 差异表达基因 ＧＯ 功能分类及富集分析 对
统计花粉活力ꎮ 因此ꎬＴＴＣ 是快速鉴定马尾松花 冷冻、化冻的花粉与对照差异表达基因的 ＧＯ 富集
粉活力较为适合的方法ꎮ 结果进行分析ꎬ共 ２８８ 个基因显著富集到 ５１ 个
２.１.２ 花粉初始含水量测定和不同含水量花粉的 ＧＯ ｔｅｒｍꎬ其中归属于生物学过程、分子功能和细胞
获取 马尾松花粉含水量随干燥时间的变化情况 组分的 ＧＯ ｔｅｒｍ 分别有 ２３ 个、１２ 个和 １６ 个( 图
如图 ２ 所示ꎮ 马尾松花粉初始含水量为 ３４.４７％ꎬ ６)ꎮ 在 ＢＰ 中ꎬ细胞过程、代谢过程、单个有机体过
干燥初期花粉含水量急速下降ꎬ后逐渐缓慢ꎮ 干 程、定位、生物学调节、应激响应等 ＧＯ ｔｅｒｍ 中富集
燥 １ ｈꎬ花粉含水量从 ３４.４７％降为 ５.９２％ꎬ干燥 ２ ｈ 基因最多ꎻ在 ＭＦ 中ꎬ催化活性、结合、转运活性、结
降为 ３.２６％ꎬ干燥 ３ ｈ 降为 ２.１５％ꎮ 构性分子活性、核酸结合转录因子活性等 ＧＯ ｔｅｒｍ
２.１.３ 含水量对超低温保存前后花粉活力影响 中富集的基因最多ꎬ抗氧化活性也显著富集ꎻ在
如图 ３ 所示ꎬ当初始含水量为 ３４.４７％和 ５.９２％时ꎬ ＣＣ 功能类别中ꎬ细胞、细胞部分、细胞器、膜等 ＧＯ
冻存前花粉活力较高分别为 ９６.６３％和 ９３.３０％ꎬ但 ｔｅｒｍ 中富集的基因最多ꎮ 其中ꎬ应激响应中富集
经超低温保存后ꎬ活力分别显著下降到 １７.４８％和 的基因可能是今后重点分析的对象ꎮ
７０.９１％ꎻ当含水量降为 ３.２６％时ꎬ冻存前后花粉活 我们重点关注的抗氧化活性 ＧＯ ｔｅｒｍ ( ＧＯ:
力分别为 ７９.３７％ 和 ７４.４１％ꎮ 之后随含水量继续 ００１６２０９) 中ꎬ ＣＫ ｖｓ ＬＤ 有 １ 个 基 因 显 著 下 调

下降为 ２.１５％ꎬ冻存前后花粉活力均显著降低ꎮ Ｐｔ２Ｇ４７７００ ( ＧＰＸＭＣ１ )ꎻ ＣＫ ｖｓ ＨＤ ２ 个 基 因
２.２ 与 ＲＯＳ 相关的生理指标的测定 Ｐｔ３Ｇ５６２４０( ＰＥＲ５６)、 Ｐｔ９Ｇ４９０２０ ( ＣＡＴ２) 差 异 表

如图 ４ 所 示ꎬ 在 １１ 个 指 标 中ꎬ ＳＯＤ、 ＧＳＨ、 达ꎻ 而 ＬＤ ｖｓ ＨＤ 没 有 差 异 表 达 基 因ꎬ 表 明
ＡＰＸ、抑制羟自由基能力 ４ 个指标在冻存过程中差 Ｐｔ２Ｇ４７７００ 可能参与冷冻过程中氧化应激响应ꎬ
异显著ꎮ 其中ꎬＳＯＤ、ＧＳＨ、抑制羟自由基能力 ３ 个 Ｐｔ３Ｇ５６２４０(ＰＥＲ５６)、 Ｐｔ９Ｇ４９０２０(ＣＡＴ２)可能参与
指标ꎬ冷冻后均显著下降ꎬ化冻后恢复到对照水 化冻过程中氧化应激响应ꎮ 这说明氧化应激响应
平ꎮ ＡＰＸ 则在冷冻保存和化冻过程中含量都较对 在冷冻和化冻过程均有发生ꎮ

照显著提升ꎮ ２.３.５ ＫＥＧＧ 富集分析 对差异表达基因的 ＫＥＧＧ
２.３ 转录组分析 富集结果进行分析ꎬ结果表明 ９６ 个差异基因被显

２.３.１ 测序数据过滤结果 ９ 个样品在 Ｃｌｅａｎ ｄａｔａ 著富集到 ７１ 个 ＫＥＧＧ 途径中ꎮ 对 ＫＥＧＧ Ｔｏｐ ２０
中质量值大于 ３０ 的碱基占比均高于 ９２.７９％ꎬ并且 富集分析研究如图 ７ 所示ꎬ差异基因主要被富集
其 ｒＲＮＡ 含量比例均低于 １％ꎮ 这表明该样品转录 到代谢、 遗传信息处理、 有机系统、 环境信息处理