Page 188 - 《广西植物》2025年第10期

１ ９ １ ８ 广 西 植 物 ４５ 卷
主要依赖于抗氧化酶及非酶抗氧化剂ꎮ 超氧化物 ４ ｇＬ 琼脂 ＋ １ ｇＬ 硼酸 ＋ １０ ｇＬ 聚乙二醇
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歧化酶 ( ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎬＳＯＤ)ꎬ 过 氧 化 物 酶 ６０００ꎬ萌 发 率 (％) ＝ 已 萌 发 花 粉 数 / 花 粉 总 数 ×
(ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬＰＯＤ)、过氧化氢酶(ｃａｔａｌａｓｅꎬＣＡＴ)、谷 １００ꎮ 以上试验均设 ３ 次重复ꎬ采用 ＳＰＳＳ 软件进
胱甘肽还原酶( ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅꎬＧＲ)、抗坏血 行数据统计分析ꎮ
酸过氧化物酶( ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬＡＰＸ) 和抗坏 (２)花粉初始含水量测定及不同含水量花粉

血酸( ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄꎬＡｓＡ)、谷 胱 甘 肽 ( ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅꎬ 的获得ꎮ 初始含水量( ω ) 的测定采用低温烘干
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ＧＳＨ)等非酶促抗氧化物质ꎮ 当 ＲＯＳ 产生与清除 法ꎬ具体参见张晓宁等(２０２０ａ) 的方法ꎬ设 ３ 个重
失衡时ꎬ细胞中积累大量 ＲＯＳꎮ 因此ꎬ开展抗氧化 复ꎬ每个重复 １ ｇꎮ 不同含水量花粉采用减重法获
酶活性及抗氧化剂含量检测ꎬ以确定在马尾松花 得ꎬ花粉平均分成两部分ꎬ测量初始重量后ꎬ在 ２５
粉超低温保存过程中是否受到氧化应激胁迫ꎬ并 ℃ 烘箱中干燥ꎬ一部分用来测量含水量ꎬ每隔 １ ｈꎬ
通过转录组测序ꎬ进一步阐述参与马尾松花粉超 测量 １ 次ꎬ直至恒重ꎮ 实际含水量 ω (％) ＝ １００％ －
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低温保存过程中的相关基因及代谢途径ꎮ [ 最初重量 × ( １００％ － 相对含水量)] / 最后重量ꎮ
本研究旨在建立一套马尾松花粉长期保存的 将获得的不同含水量的花粉置于冷冻管中 ４ ℃ 保
技术方法ꎬ并通过检测冻存过程中与 ＲＯＳ 相关的 存备用ꎮ
一些抗氧化酶和非酶抗氧化物质的活性或含量ꎬ (３)含水量对冻后花粉活力的影响ꎮ 将不同
联合转录组测序阐述马尾松花粉超低温保存过程 含水量的马尾松花粉ꎬ投入液氮进行冷冻保存 ４８
中与 ＲＯＳ 相关的生理响应及可能参与损伤或保护 ｈ 后ꎬ将冷冻后的花粉采用室温空气化冻ꎮ 采用
的基因及代谢途径ꎮ 本研究结果可为马尾松花粉 ＴＴＣ 法检测冻后花粉活力ꎬ确定最适含水量ꎮ
长期保存提供一种有效的形式ꎬ对保障种质资源 １.２.２ 马尾松花粉冷冻保存过程中生理指标检测
安全及高效利用具有重要意义ꎬ同时也为解析超 供试材料为冷冻保存前的( ｂｅｆｏｒｅ ｆｒｅｅｚｉｎｇꎬＣＫ)ꎬ
低温保存分子和生理机理提供理论依据ꎮ 液氮冻存 ４８ ｈ 后( ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｗｉｔｈ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｆｏｒ ４８ ｈꎬ ＬＤ ｆｏｒ ４８ｈ)ꎬ 化 冻 后 ( ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ
１ 材料与方法 ｔｈａｗｉｎｇꎬＨＤ) 的花粉ꎮ 委托南京建成生物工程研
究所检测其丙二醛( ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅꎬＭＤＡ) 含量、
１.１ 材料 超氧化物歧化酶(ＳＯＤ)、过氧化物酶( ＰＯＤ)、过氧
供试材料为马尾松花粉ꎬ２０２１ 年 ３ 月采自广 化氢酶(ＣＡＴ)、抗坏血酸过氧化物酶( ＡＰＸ)、谷胱
西藤县大芒界国家种子园ꎬ树龄范围为 １０ ~ １２ 年ꎮ 甘肽还原酶( ＧＲ) 活性ꎬ抗坏血酸( ＡｓＡ)、谷胱甘
待马尾松雄球花小孢子叶球微微发黄至散粉期 肽(ＧＳＨ)含量、过氧化氢( Ｈ Ｏ ) 含量ꎬ抗超氧阴
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间ꎬ选择晴天上午ꎬ采集花穗棒ꎬ用牛皮纸包好ꎬ带 离子自由基、抑制羟基自由基能力等ꎮ 具体方法
回实验室ꎻ用尖头小镊子将花穗棒上的小花穗拔 参见试 剂 盒 ( 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所) 使 用
下ꎬ置于 １５ ｃｍ 培养皿中ꎬ于超净工作台日光灯下 说明ꎮ

静置 ２４ ~ ９６ ｈꎮ 收集散开的花粉ꎮ １.２.３ 马尾松花粉冷冻保存过程转录组测序分析
１.２ 方法 (１) 测序数据过滤及表达分析ꎮ 提取样品总
１.２.１ 马尾松花粉超低温保存技术体系的建立 ＲＮＡꎬ用 ｍｉｒＶａｎａ ＴＭ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ (Ａｍｂｉｏｎ１５６１)
(１)花粉活力检测方法比较ꎮ 新鲜马尾松花 试剂盒提取和纯化马尾松总 ＲＮＡꎬＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００

粉利 用 氯 化 三 苯 基 四 氮 唑 ( ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ (美国ꎬＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ) 与 Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００
ｃｈｌｏｒｉｄｅꎬ ＴＴＣ )、 二 乙 酸 荧 光 素 ( ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ( 美国ꎬＡｇｉｌｅｎｔ) 进行总 ＲＮＡ 质量和纯
ｄｉａｃｅｔａｔｅꎬＦＤＡ)及离体培养法比较花粉活力ꎬ具体 度 检 测ꎬ 构 建 ｃＤＮＡ 文 库ꎮ 以 油 松 ( Ｐｉｎｕｓ

方法参 见 张 晓 宁 等 ( ２０２３)ꎬ 利 用 Ｉｍａｇｅ Ｊ ( Ｆｉｊｉ) ｔａｂｕｌｉｆｏｒｍｉｓ) 基 因 组 ( 基 因 组 序 列: ｈｔｔｐｓ: / / ｄｂ.
(Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎꎬｅｔ ａｌ.ꎬ２０１２)计数ꎮ ＴＴＣ 染色法花粉活 ｃｎｇｂ. ｏｒｇ / ｓｅａｒｃｈ / ｐｒｏｊｅｃｔ/ ＣＮＰ０００１６４９ / ꎬ ｇｆｆ 文 件:
力(％)＝ 红色花粉粒 / 总花粉粒 × １００ꎮ ＦＤＡ 染色 ｈｔｔｐｓ: / / ｆｉｇｓｈａｒｅ. ｃｏｍ / ａｒｔｉｃｌｅｓ/ ｄａｔａｓｅｔ/ Ｐｉｎｕｓ ＿
花粉活力(％)＝ 发出黄绿色荧光的花粉粒 / 总花粉 ｔａｂｕｌｉｆｏｒｍｉｓ＿ｇｅｎｅ＿ｓｐａｃｅ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ / １６８４７１４６ / ２) 为
粒×１００ꎮ 离体培养法中离体培养基为 １０％蔗糖＋ 参考进行比对分析ꎮ