Page 187 - 《广西植物》2025年第10期

１０ 期 张晓宁等: 马尾松花粉超低温保存的生理响应及转录组分析 １ ９ １ ７

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｐｉｎｕｓ
ｍａｓｓｏｎｉａｎａ ｐｏｌｌｅｎ ｔｏ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｐｏｌｌｅｎ ｏｆ Ｐ. ｍａｓｓｏｎｉａｎａꎬ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｂｊｅｃｔꎬ ｗａｓ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ
ｎｉｔｒｏｇｅｎ (ＬＮ)ꎬ ａｔ －１９６ ℃. Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｅｘｅｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ (ＲＯＳ) ｗｅｒｅ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ
ｔｈｅ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ( ＣＫ: ｂｅｆｏｒｅ ｆｒｅｅｚｉｎｇꎻ ＬＤ: ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｗｉｔｈ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎꎻ ＨＤ: ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ
ｔｈａｗｉｎｇ). Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗａｓ ａｌｓｏ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ( ＮＧＳ) ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
ＴＭ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ６０００ ｐｌａｔｆｏｒｍ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: (１) Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｆｏｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｗａｓ
３.９６％ (ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ ｂａｓｉｓ). Ａｔ ｔｈｉｓ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ｔｈｅ Ｐ. ｍａｓｓｏｎｉａｎａ ｐｏｌｌｅｎ ｗａｓ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎꎬ
ｗｈｅｒｅ ｉｔ ｗａｓ ｓｔｏｒｅｄ ｆｏｒ ａｔ ｌｅａｓｔ ４８ ｈꎬ ｔｈｅｎ ｗａｓ ｒｅｍｏｖｅｄ ｆｒｏｍ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ２０
ｍｉｎｕｔｅｓ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｔｈａｗｉｎｇ. Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｗａｓ ７３.８０％ ａｆｔｅｒ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈａｗｉｎｇꎬ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ７８.５４％ ｂｅｆｏｒｅ
ｆｒｅｅｚｉｎｇ. (２) Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓꎬ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｉｎｄｅｘｅｓ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ
ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ( ＳＯＤ)ꎬ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ( ＧＳＨ)ꎬ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ( ＡＰＸ)ꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｆｒｅｅ
ｒａｄｉｃａｌｓ. (３) Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ６５.６０ Ｇｂ ｃｌｅａｎ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬ ｗｉｔｈ ３８ ５０５ ｇｅｎｅｓ ｍａｐｐｅｄ ｔｏ
ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ (４７.８４％)ꎻ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ (ＤＥＧｓ) ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ＣＫ ｖｓ ＬＤꎬ ＣＫ
ｖｓ ＨＤꎬ ａｎｄ ＬＤ ｖｓ ＨＤ ｗｅｒｅ ２３２ꎬ ２６８ꎬ ａｎｄ ２１８ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔｕｄｙꎬ Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ (ＧＯ) ａｎｄ Ｋｙｏｔｏ
Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ ( ＫＥＧＧ) ａｎａｌｙｓｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＧＯ ｔｅｒｍｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｔｉｍｕｌｕｓ ａｎｄ
ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙꎻ ＫＥＧＧ ｐａｔｈｗａｙｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｐｌａｎｔ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎꎬ ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙꎬ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ
ｓｕｃｒｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍꎬ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ａｎｄ ｍａｎｎｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍꎬ ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ. Ｔｅｎ ｇｅｎｅｓ
ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｐａｔｈｗａｙｓ ｔｈａｔ ｍａｙ ｂｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｄｕｒｉｎｇ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｃｒｅｅｎｅｄ. Ａｌｌ
ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ａｎｄ ｔｈａｗｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＲＯＳ ａｆｆｅｃｔｓ ｔｈｅ
ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ. ｍａｓｓｏｎｉａｎａ ｐｏｌｌｅｎꎬ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｈｅｌｐ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｌｅｎ ｏｆ Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａꎬ ａｎｄ ａｌｓｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｄａｍａｇｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａꎬ ｐｏｌｌｅｎꎬ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ

马尾松(Ｐｉｎｕｓ ｍａｓｓｏｎｉａｎａ) 是我国南方三大速 ２０２１)ꎮ 轻木花粉在液氮中保存 ４０ ｄ 后ꎬ花粉的活
生树种之一ꎬ种植面积居我国乔木之首ꎬ具有重要 力为 ７２％ꎬ效果好于其他低温保存方式( 席会鹏
的经 济 价 值 ( 秦 国 峰 和 周 志 春ꎬ ２０１２ꎻ 杨 章 旗ꎬ 等ꎬ２０２３)ꎮ 丝瓜、大豆花粉经超低温保存后在萌
２０１２)ꎬ但由于松材线虫危害ꎬ种质资源安全正受 发率、受精率、结实率方面与新鲜花粉没有明显差
到严重威胁ꎮ 花粉包含个体发育所需要的全部基 异(Ｊｉａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ꎻ Ｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２３)ꎮ 黑加仑花
因ꎬ遗传信息极其丰富ꎬ是种质保存、交换、人工辅 粉在液氮中保存 １２ 个月ꎬ其活力甚至较保存前提
助授粉及杂交育种的重要材料ꎮ 自然状态下ꎬ马 高 了 ０. ９％ ( Ｔｉｋｈｏｎｏｖａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１ )ꎮ 徐 进 等
尾松花粉的寿命只有 １ 个月ꎬ很难解决植物杂交 (１９９８)指出ꎬ若在干燥的前提下将马尾松花粉保
育种中的花期不遇及地理隔离等问题ꎬ而一般的 存在－６０ ℃ 以下的超低温冰箱里或液氮中ꎬ可使
花粉保存技术如常温干燥和 ４ ℃ 低温干燥最多贮 其生活力保存更长时间ꎮ 遗憾的是ꎬ目前并未见
存 １１ 个月ꎬ－２０ ℃ 低温干燥可保存 ２５ 个月ꎬ但生 关于马尾松花粉超低温保存的研究报道ꎮ
活力 均 降 到 １０％ 以 下 ( 徐 进 等ꎬ １９９８ꎻ 谭 健 晖ꎬ 尽管理论上利用超低温技术可以实现材料的
２０１１)ꎮ 因此ꎬ开展经济、高效的花粉长期保存技 长期保存ꎬ但是实际操作过程中有许多因素会影
术研究对于保障马尾松种质资源安全及高效利用 响冻存效果ꎬ甚至造成材料死亡ꎮ 除材料本身的
具有重要意义ꎮ 特性以 外ꎬ 花 粉 含 水 量、 活 性 氧 ( ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ
超低温保存通常指将生物材料采用一定技术 ｓｐｅｃｉｅｓꎬＲＯＳ)诱导的氧化应激反应和细胞程序性
存入液氮中保存ꎬ使用时采取一定方法使其恢复 死亡是细胞损伤的主要原因( Ｌｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１９ꎻ 张
生长ꎮ 该方法能够实现花粉的长期保存并提高育 晓宁 等ꎬ ２０２０ａꎬ ｂꎻ 任 瑞 芬 等ꎬ ２０２２ꎻ Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ
种 效 率 ( Ｄｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ꎻ Ｇｏｗｔｈａｍｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ａꎬｂ)ꎮ ＲＯＳ 是有氧代谢的副产物ꎬ可以清除