Page 193 - 《广西植物》2025年第11期
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１１ 期 郭堂丽等: 福建万木林大叶梅属地衣内生真菌群落多样性及功能预测 ２ １ ３ ７
梅ꎬ３ 份ꎻ大叶梅ꎬ１３ 份) (表 １)ꎮ 样品放入采集袋ꎬ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄꎬＭＬ ) 进 行 系 统 发 育 树 构 建ꎮ 采 用
带回实验室冷冻保存ꎮ 地衣标本保存于聊城大学 ＲＡｘＭＬ￣ＨＰＣｖ. ８ 进 行 最 大 似 然 自 举 分 析
农业与生物学院菌物标本馆(ＬＣＵＦ)ꎮ (Ｓｔａｍａｔａｋｉｓꎬ ２０１４)ꎬ使用默认参数ꎬＮＳＦＸＳＥＤＥ 资
１.２ 地衣内生真菌的分离纯化 源ꎬ对每个节点以假设１ ０００个复制值来评价自展
地衣样品采用组织分离法( 郭堂丽等ꎬ２０２４) 值ꎮ 生成的系 统 发 育 树 在 Ｆｉｇｔｒｅｅ ｖ１. ４. ２ 下 可 视
进行处理后接种到 ＰＤＡ 培养基ꎮ 将平板在 ２５ ℃ 化ꎮ ＭＬ 自举(ｂｏｏｔｓｔｒａｐꎬＢＳ) 值大于等于 ７０％的被
恒温培养箱中培养 ５ ~ ７ ｄꎬ每日观察ꎬ待菌丝从地 认为显著支持ꎮ
衣体组织块周围长出后ꎬ从边缘挑取菌丝移至新 １.４ 地衣体 ＤＮＡ 提取与高通量测序
的 ＰＤＡ 平板上进行纯化ꎮ 进行多次纯化ꎬ直至得 同上述组织分离法对地 衣 体 表 面 灭 菌 处 理
到单一菌落ꎻ将纯化好的菌株接种于 ＰＤＡ 斜面培 后ꎬ对 １６ 份地衣体进行微生物多样性分析ꎬ样品
养基ꎬ保存于 ４ ℃ 冰箱ꎮ 信息编号见表 １ꎮ 采用 ＴＧｕｉｄｅ Ｓ９６ 磁珠法土壤 / 粪
１.３ 培养菌株的形态特征观察及分子鉴定 便基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒提取地衣体基因组总
(１)地衣内生真菌的形态观察:将纯化得到的 ＤＮＡꎬ具体方法参照 ＴＧｕｉｄｅ Ｓ９６ 磁珠法土壤 / 粪便
地衣内生真菌菌株接种到 ＰＤＡ 培养基中ꎬ２５ ℃ 培 基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒说明书ꎮ 扩增真菌 ＩＴＳ１
养 ５ ~ ７ ｄ 后观察菌落正反面特征并拍照记录ꎮ 挑 基 因 的 引 物 是 ＩＴＳ１ ( 同 上 ) 和 ＩＴＳ２ ( ５′ －
取菌丝ꎬ制备水装片于显微镜下观察并记录菌丝 ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ－３′) ( ｄｅ Ｂｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ
形态ꎬ包括菌丝的粗细、颜色及孢子的形态特征 ２０１４)ꎬ扩增后的 ＰＣＲ 产物用 １.８％的琼脂糖凝胶
(周璇等ꎬ２０２１)ꎮ (２) ＤＮＡ 提取、ＩＴＳ 序列的扩增 电泳检测ꎮ 检测合格的 ＰＣＲ 产物委托北京擎科生
与测序:采用高效植物基因组 ＤＮＡ 提 取 试 剂 盒 物科技股份有限公司测序在 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ 测序
(北京擎科生物科技股份有限公司) 进行地衣内生 平台上进行高通量测序ꎮ
真菌基因组的提取ꎮ 以内生真菌的总 ＤＮＡ 为模 １.５ 高通量测序数据处理
板ꎬ 使用真菌通用引物 ＩＴＳ１(５′－ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡ 采 用 Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ ｖ. ０. ３３ ( Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ
ＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ－３′)和 ＩＴＳ４ (５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴ ２０１４)和 Ｃｕｔａｄａｐｔ ｖ. １.８.３ ( Ｍａｒｔｉｎꎬ２０１１) 对原始
ＴＧＡＴＡＴＧＣ － ３′) 进 行 ＰＣＲ 扩 增 ( Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ＰＥ Ｒｅａｄｓ 进行质量过滤与引物切除ꎬ随后根据目
１９９０ꎻＧａｒｄｅｓ ＆ Ｂｒｕｎｓꎬ １９９３)ꎮ ＰＣＲ 反应体 系 为 标分辨率选择 ＤＡＤＡ２ ( 单核苷酸精 度 去 噪 生 成
ｄｄＨ Ｏ １９ μＬ、２ × Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ [ 天根生化 ＡＳＶｓ) ( Ｃａｌｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６) 和 ＵＳＥＡＲＣＨ ｖ. １０
２
科技(北京)有限公司] ２５ μＬ、上游引物 ２ μＬ、下 (相似性聚类生成 ＯＴＵｓ) 进行序列拼接及嵌合体
游引物 ２ μＬ、ＤＮＡ 模板 ２ μＬꎬ共 ５０ μＬ 体系ꎮ ＰＣＲ 去 除 ( Ｅｄｇａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１ꎻ Ｅｄｇａｒꎬ ２０１３ )ꎻ 基 于
反应过程:预变性 ９５ ℃ ５ ｍｉｎꎬ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５２ ＱＩＩＭＥ ２ ｖ.２０２０.６ 结合 ＵＮＩＴＥ 数据库完成 ＡＳＶ 分
℃ 退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎꎬ３４ 个循环ꎻ最后 ７２ 类学注释( Ｂｏｌｙｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎬ并通过宿主基因
℃ 延伸 １０ ｍｉｎ(郭堂丽等ꎬ２０２４)ꎮ 目的产物经 １％ 组比对过滤地衣大叶梅属的序列ꎬ最终利用 α / β
琼脂糖凝胶电泳确认后由北京擎科生物科技股份 多样性指数和 ＦＵＮＧｕｉｌｄ 功能注释解析真菌群落
有限公司进行双向测序ꎮ (３)系统发育树的构建: 结构与生态功能( Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎬ结果通过
测序结 果 在 ＮＣＢＩ 数 据 库 中 进 行 ＢＬＡＳＴ 同 源 比 Ｒ 语言和 ＱＩＩＭＥ ２ 可视化呈现ꎮ
对ꎬ下载相似序列ꎮ 选取毛霉门( Ｍｕｃｏｒｏｍｙｃｏｔａ) 伞
枝霉属( Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ Ａｍｏｓ ＆ Ｈ. Ｌ. Ｂａｒｎｅｔｔ) 物种作 ２ 结果与分析
为外类群(Ｓｐａｔａｆｏｒａ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１７ꎻ娄亚坤等ꎬ２０２３)ꎮ
利用 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ ｖ９.０.２ 软件对所测得的两条互补序 ２.１ 组织培养分离的内生真菌鉴定
列进行拼接组装ꎬ使用 ＭＡＦＦＴ ｖ.７ 并选择“ Ｌ￣ＩＮＳ￣ 从 １６ 份大叶梅属地衣标本中经纯培养共得到
ｉ”运算 法 则 进 行 多 序 列 比 对 ( Ｋａｔｏｈ ＆ Ｓｔａｎｄｌｅｙꎬ ７０ 株内生真菌ꎬ地衣标本相关采集信息以及分离
２０１３)ꎮ 比对后的序列矩阵在首尾处进行手动删 得到的内生真菌数量如表 １ 所示ꎮ
减ꎮ 使 用 ＣＩＰＲＥＳ 科 学 门 户 网 站 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. 将 ＩＴＳ 测 序 结 果 通 过 ＮＣＢＩ 数 据 库 网 站
ｐｈｙｌｏ. ｏｒｇ / ｐｏｒｔａｌ２ / ) 采 用 最 大 似 然 法 ( ｍａｘｉｍｕｍ ＢＬＡＳＴ 在线比对搜索同源序列ꎬ并进行分子系统
