Page 132 - 《广西植物》2025年第12期
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２ ２ ７ ４ 广 西 植 物 ４５ 卷
湿带回实验室ꎬ用 Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＳ２１０Ｓ 型电子天平(精 本在样本中的每百万个映射读取的转录本每千碱
度为 ０. ０００ １ ｇ) 称 量 每 个 铝 盒 中 的 土 壤 鲜 重 基片段数( ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏ ｂａｓｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｒｅａｄ
(Ｗ )ꎻ再将铝盒中土壤置于 ８０ ℃ 的烘箱中烘干 ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｓꎬＦＰＫＭ)ꎬ以该值作为基因 / 转录本
１
７２ ｈ 后称量土壤干重( Ｗ )ꎬ计算土壤含水量为 Ｗ 在样本中的表达量ꎮ
２
(％)＝ (Ｗ －Ｗ ) / Ｗ ( 钱胜国ꎬ１９８６)ꎮ 同时ꎬ为分 １.２.３.３ 差异基因的表达分析 使用 ｔ￣ｔｅｓｔ 分析转
１ ２ ２
析不同颜色长短花柱植株根系土壤元素的差异ꎬ 录本和基因水平上的差异表达ꎮ 筛选差异表达基
随机选取不同颜色花植株根系周边采集土壤样 因( ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓꎬ ＤＥＧｓ) 的 标 准 如
本ꎬ放入封口塑料袋中带回实验室ꎻ土壤经自然晒 下:表达 倍 数 满 足 ｜ ｌｏｇ ( Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ) ｜ > １ꎻ 对 Ｐ
２
干并过筛后ꎬ采用电感耦合等离子体发射光谱仪 ｖａｌｕｅ 进行 ＦＤＲ 矫正ꎬ同时满足 Ｐ ｖａｌｕｅ< ０.０５ 和
(ＩＣＰ￣ＯＥＳꎻＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ａｖｉｏ２００ꎬＭＡꎬＵＳＡ) 进行元 Ｐ.ａｄｊ 值 < ０.０５ꎮ 对筛选出的差异表达基因进行
素测定ꎮ 使用 ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥＬＡＮ 公司提供的混合 ＧＯ 和 ＫＥＧＧ 富集分析ꎬ以筛定与花色多态相关的
标样 Ｋｉｔ 包 作 为 标 准 品ꎮ 计 算 公 式 为 样 品 含 量 候选基因ꎮ
(ｇｋｇ )＝ (Ｃ×Ｖ×Ｆ) / Ｍꎬ式中:Ｃ 为仪器读取的样 １.３ 统计分析
￣１
品浓度ꎬＶ 为样品最终定容体积ꎬＦ 为样品稀释倍 所有实验数据首先使用 Ｅｘｃｅｌ ３６５ 软件进行初
数ꎬＭ 为样品称量质量(中华人民共和国国家卫生 步整理ꎬ并用 ＳＰＳＳ ２７.０ 软件进行统计分析ꎮ 在分
和计划生育委员会ꎬ国家食品药品监督管理总局ꎬ 析之前ꎬ用 Ｅｘｐｌｏｒｅ 命令对数据进行正态性及方差
２０１６)ꎮ 齐性检验ꎬ对不服从正态分布及方差齐性的数据
１.２.３ 不同花色花冠的转录组学分析 在自然种 进行数据转换ꎬ服从正态分布后进行进一步分析ꎬ
群花期内ꎬ随机采集刚开放且花药未开裂的不同 若经过转换仍不符合要求的数据ꎬ则采用非参数
花色长短花柱植株花冠样本ꎬ每种花色花冠各采 检验ꎮ 利用单因素方差分析来检验不同颜色花的
集 ５ 朵花ꎬ放入 １０ ｍＬ 的离心管中ꎬ每种颜色花设 植株土壤矿物质元素差异ꎬ利用广义线性模式分
置 ６ 个重复ꎬ并立即投入液氮中速冻ꎬ带回实验室 析不同颜色花植株根系土壤相对含水量差异ꎮ
进行以下处理及分析ꎮ
１.２.３.１ 总 ＲＮＡ 的提取及测序文库的构建 使用 ２ 结果与分析
ＴＲｉｚｏｌ 法提取 ４ 种花色花冠的总 ＲＮＡꎬ每样品设
置 ３ 个生物学重复ꎮ 利用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００ 检测已 ２.１ 不同颜色花冠的定量测定
提取 ＲＮＡ 的浓度和纯度ꎬ并通过琼脂糖凝胶电泳 由图 ２ 可知ꎬ帕米尔报春 ４ 种颜色花冠的色彩
检测 ＲＮＡ 完整性ꎮ 利用 Ｏｌｉｇｏ(ｄＴ)富集总 ＲＮＡ 中 参数存在差异ꎮ 随着帕米尔报春花的花冠颜色从
的 ｐｏｌｙＡ 结构 ｍＲＮＡꎬ 并通过 Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ 白色逐渐加深至紫色ꎬ４ 种花色花花冠的明度( Ｌ ∗
方法将其随机打断ꎬ筛选出 ３００ ｂｐ 的小片段ꎮ 以 值)呈现出逐渐减弱的趋势ꎻ在红绿平衡上ꎬ白色
ｍＲＮＡ 为模板ꎬ在逆转录酶的作用下合成 ｃＤＮＡꎬ 花花冠的 ａ ∗ 值为负ꎬ表明其偏向绿色ꎬ而其余 ３
并通过 ＰＣＲ 扩增富集文库片段ꎬ使用 ２％琼脂糖胶 种颜色花冠的 ａ 值均为正值ꎬ表明偏向红色ꎬ其
∗
回收目的条带ꎬ再利用二代高通量测序平台进行 中白色花和浅白色花花冠的 ａ 值接近 ０ꎬ几乎无
∗
转录组测序ꎮ 采用 ＲＳｅＱＣ 软件对转录组的数据进 红绿偏向ꎬ随着花冠颜色从浅紫色向紫色加深ꎬ花
行整体质量评估ꎬ确保质量评估合格后的测序数 冠的偏红程度逐渐增强ꎻ在黄蓝平衡上ꎬ４ 种花色
据经过生物信息学的分析ꎬ以体现出真实的实验 花花冠的 ｂ 值均为负值ꎬ表明均偏向蓝色且随着
∗
结果ꎮ 颜色的加深ꎬ偏蓝程度逐渐增加( 图 ２)ꎮ 这些色
１.２.３.２ 基因功能注释及基因表达量分析 使用 彩空间参数的变化表明ꎬ花冠颜色的深浅与光谱
Ｓｔｒｉｎｇｔｉｅ 软件合并各样本拼接得到的转录本ꎬ并利 反射特性之间存在紧密的关联性ꎬ反映了植物色
用 Ｇｆｆｃｏｍｐａｒｅ 软件与已知数据库进行比较ꎻ使用 素积累与光谱响应之间的动态关系ꎮ
ＤＩＡＭＯＮＤ Ｂｌａｓｔｐ 软 件 将 所 有 基 因 与 ＫＯＧ、 ＧＯ、 ２.２ 不同颜色花植株根系周边土壤水分及矿物质
ＫＥＧＧ、Ｐｆａｍ、ＣＡＺｙ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＮＲ 等数据库进行序 元素差异性分析
列比对ꎬ获得对应注释信息ꎮ 计算每个基因 / 转录 由图 ３ 可知ꎬ帕米尔报春不同颜色花植株的根
