Page 62 - 《广西植物》2025年第12期

２ ２ ０ ４ 广 西 植 物 ４５ 卷
９ꎬ将 马 尔 科 夫 链 蒙 特 卡 洛 ( Ｍａｒｋｏｖ ｃｈａｉｎ Ｍｏｎｔｅ ｌｍｍｅ.ａｃ.ｃｎ / ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔｏｒ/ ) 中进行分析ꎬ最终得
ＣａｒｌｏꎬＭＣＭＣ) 的初始次数设置为 １０ ０００ꎬＭＣＭＣ 设 到蒙古黄芪最佳居群的分组数(高慧霞等ꎬ２０２５)ꎮ
置为 １００ ０００ꎬ 对 每 个 Ｋ 进 行 ９ 次 独 立 迭 代ꎬ 将 基于 ＭＳＬ 的 Ｎｅｉ’ｓ 遗传距离ꎬ利用 ＭＥＧＡ １１.０ 软件

ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ 结 果 在 ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔｏｒ ( ｈｔｔｐｓ:/ / 进行 ＮＪ 聚类分析ꎬ构建系统发育树ꎮ

表 ２ 引物序列信息
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ

序列名称
ＥｃｏＲ Ｉ Ｈｐａ Ⅱ / Ｍｓｐ Ｉ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｎａｍｅ
接头序列 ＥＡ１: ５′￣ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ￣３′ ＨＭＡ１: ５′￣ＧＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴ￣３′
Ａｄａｐｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＥＡ２: ５′￣ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＣＡＧＴＣＴＡＣ￣３′ ＨＭＡ２: ５′￣ＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴＧＡ￣３′
预扩增序列
Ｅ０: ５′￣ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡ￣３′ ＨＭ０: ５′￣ＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＧＧ￣３′
Ｐｒｅ￣ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ

达 ９８５ 条ꎬＥ２ ＋ ＨＭ１０ 引物扩增条带最少ꎬ有 １９２
２ 结果与分析 条ꎮ 不同的扩增条带代表了不同的酶切位点ꎬ在

所有扩增位点中分别产生了 １ ４７１ 个甲基化敏感
２.１ 选择性扩增引物的筛选 位点(ＭＳＬ)和 ４ ４９７ 个非甲基化位点( ＮＭＬ)ꎬＥ１＋
本试验利用 ＣＴＡＢ 法对 ８ 个居群共 ２５９ 份蒙 ＨＭ９ 扩增的 ＭＳＬ 最多 ( ３４６)ꎬＥ１ ＋ ＨＭ１２ 扩 增 的
古黄芪基因组 ＤＮＡ 进行提取ꎬ用 １％琼脂糖凝胶 ＭＳＬ 多态性位点百分比最高(７９％)ꎬＥ２＋ＨＭ１０ 扩
进行电泳检测ꎬ结果得到蒙古黄芪样本 ＤＮＡ 条带 增的 ＭＳＬ 最 少 ( ２０) 且 多 态 性 位 点 百 分 比 最 低
清晰、明亮ꎬ无拖尾、无降解(图 １:Ａ)ꎬ说明本试验 (５０％)ꎻＥ１＋ＨＭ９ 扩增的 ＮＭＬ 最多(６３８)ꎬ多态性
所提取的 ＤＮＡ 质量良好ꎬ保证了后续 ＭＳＡＰ 实验 位点百分比最高(３９％)ꎬＥ２ ＋ ＨＭ１０ 扩增的 ＮＭＬ
酶切反应中限制性内切酶能够特异性识别并切割 最少且多态性位点百分比最低(１７２ꎬ１８％)ꎮ 综上

ＣＣＧＧ 位点ꎮ 利用 ＥｃｏＲ Ｉ / Ｈｐａ Ⅱ和 ＥｃｏＲ Ｉ / Ｍｓｐ Ｉ 所述ꎬＭＳＬ 多态性位点百分比均大于 ＮＭＬꎬ表明筛
双酶切组合对不同蒙古黄芪居群的样本 ＤＮＡ 进 选出的 １０ 对选择性扩增引物能够有效地检测到
行酶切ꎬ通过 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ结果得到 蒙古黄芪甲基化敏感位点ꎮ
样本 ＤＮＡ 的主带消失ꎬ呈弥散分布ꎬ说明酶切完 ２.３ 蒙古黄芪 ＤＮＡ 甲基化模式和水平分析
全(图 １:Ｂ)ꎻ将酶切产物进行接头序列连接与预 非甲基化或甲基化相对水平是非甲基化或甲
扩增ꎬ用 １％琼脂糖凝胶进行电泳检测ꎬ得到预扩 基化位点( 包括半甲基化位点和全甲基化位点的
增产物条带明亮、清晰ꎬ说明预扩增效果良好( 图 总数)在所有条带总数中所占的百分比ꎮ 本试验
１:Ｃ)ꎮ 选用本试验设计的 ６４ 对引物对 ２５９ 份蒙 利用 Ｒ ４.４.１ 软件 ｍｓａｐ 包对 ８ 个蒙古黄芪居群样

古黄芪基因组 ＤＮＡ 进行选择性扩增ꎬ并通过 １.５％ 本的 ＤＮＡ 甲基化模式和水平进行分析ꎬ结果如表
琼脂糖凝胶电泳检测引物多态性( 图 ２)ꎬ结果得 ５ 所示ꎬ蒙古黄芪居群总甲基化水平在 ５４.５５％ ~
到 ６４ 对引物中有 １０ 对引物条带清晰、多态性良 ６８.１６％ 之 间ꎬ 均 值 为 ６２. ６４％ꎬ 非 甲 基 化 水 平 在
好ꎬ可用于后续表观遗传多样性试验ꎮ 引物序列 ３１.８４％ ~ ４５.４５％之间ꎬ均值为 ３７.３６％ꎬ表明蒙古

见表 ３ꎮ 黄芪有半数以上的胞嘧啶 ＣＣＧＧ 位点被甲基化ꎻ
２.２ 选择性扩增引物的多态性分析 全甲基化水平在 ３０. １２％ ~ ３６. ９２％ 之 间ꎬ均 值 为
本试验利用 Ｒ ４.４.１ 软件中 ｍｓａｐ 包统计 １０ 对 ３３.３９％ꎻ半甲基化水平在 ２４.４３％ ~ ３５.８２％之间ꎬ
选择性扩增引物扩增总条带数、ＭＳＬ 和 ＮＭＬꎬ计算 均值为 ２９.２５％ꎬ表明蒙古黄芪以全甲基化模式为
多态性位点百分比ꎬ结果如表 ４ 所示ꎬ１０ 对选扩引 主ꎮ 不同蒙古黄芪居群内 ＤＮＡ 甲基化水平有明
物共扩增出 ５ ９６９ 条条带ꎬ扩增产物大小在 ３５ ~ 显 的 区 别ꎬ 其 中 山 西 破 兑 臼 居 群 总 甲 基 化
６３５ ｂｐ 之间ꎬ其中 Ｅ１＋ＨＭ９ 引物扩增条带数最多ꎬ (５４.５５％) 、全甲基化(３０.１２％) 和半甲基化水平