Page 74 - 《广西植物》2025年第12期

２ ２ １ ６ 广 西 植 物 ４５ 卷
经历扩张和收缩事件ꎻ(３) 甘草居群可能存在的冰 利用 Ｅｄｉｔｓｅｑ 软件对序列进行 ＧＣ 含量计算ꎻ利用
期避难所和起源中心ꎮ 本研究以期为甘草种质资 ＭＥＧＡ ７.０ 软件对序列进行对比ꎮ 选择蓝花棘豆
源的保护与利用、物种形成机制的研究提供理论 (Ｏｘｙｔｒｏｐｉｓ ｃａｅｒｕｌｅａ)和苦马豆(Ｓｐｈａｅｒｏｐｈｙｓａ ｓａｌｓｕｌａ)

依据ꎮ 为外 类 群 ( ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号 分 别 为 ＬＲ８９８４６０. １、
ＭＨ７１４１２０.１、ＬＲ８９８２７０.１、ＬＲ８９８４２７.１ 和 ＭＴ９２３６５０.１、
１ 材料与方法 ＭＴ９１８２５１.１、ＫＰ３３８４７４.１、ＫＸ９４２２９４.１)ꎮ 利用最

大似然法( ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄꎬ ＭＬ) 分别构建 ＩＴＳ
１.１ 材料 和 ｃｐＤＮＡ 的单倍型系统发育树ꎻ利用 ＤｎａＳＰ ５.０

甘草样本采自中国西北和华北地区的宁夏、 软件统计 ＩＴＳ 序列和拼接后 ｃｐＤＮＡ 序列的长度、
青海、山西、陕西、甘肃、新疆及内蒙古 ７ 个省( 区) 变异位点、居 群 单 倍 型 数 量 ( ｈ)、 单 倍 型 多 样 性
２０ 个居群ꎬ个体叶样分别保存于变色硅胶中带回 ( ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈ )、 核 苷 酸 多 样 性
ｄ
实验室ꎮ 各居群随机选择 ５ 份叶样用于基因组 (ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｐ )、中性检验 Ｔａｊｉｍａ’ ｓ Ｄ 和
ｉ
ＤＮＡ 的提取(表 １)ꎮ 植物样本由山西农业大学生 Ｆｕ’ｓ Ｆｓ 值ꎬ并进行失配分析以检测甘草居群是否
命科 学 学 院 刘 亚 令 教 授 鉴 定 为 甘 草 ( Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ 经历扩张事件ꎻ利用 ＰｅｒｍｕｔＣｐＳＳＲ 软件计算甘草
ｕｒａｌｅｎｓｉｓ)ꎬ凭证标本保存于山西农业大学生命科 总 遗 传 多 样 性 ( ｔｏｔａｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ
学学院中药标本室ꎮ Ｈ )、居群内平均遗传多样性( ｍｅａｎ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ
ｔ
１.２ 甘草基因组 ＤＮＡ 提取 ｗｉｔｈｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎬ Ｈ )、遗传分化系数( ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｓ
将干燥的甘草叶片放入高通量组织研磨仪中 ｏｆ ｇｅｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬＮ 和 Ｇ )ꎬ判断甘草居群间
ｓｔ ｓｔ
进行研 磨ꎬ 采 用 改 良 的 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 是否存在明显的谱系地理结构ꎻ利用 Ａｒｌｅｑｕｉｎ 软件
( ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅ￣ｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅꎬ ＣＴＡＢ ) 法 进行分子方差分析( ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｎｃｅꎬ
(Ｃａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)提取基因组 ＤＮＡꎬ利用核酸蛋白 ＡＭＯＶＡ)ꎬ检测甘草居群间及居群内变异ꎬ计算居
仪检测 ＤＮＡ 样本浓度ꎬ测定 Ａ / Ａ 值ꎮ 利用 １％ 群间遗 传 分 化 系 数 ( Ｆ ) 及 基 因 流 ( ｇｅｎｅ ｆｌｏｗꎬ
２６０ ２８０ ｓｔ
琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ 样本质量ꎮ Ｎ )ꎻ利用 Ｎｅｔｗｏｒｋ 软件基于 Ｍｅｄｉａｎ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ 绘制单
ｍ
１.３ ＰＣＲ 扩增及检测 倍型网络图ꎻ利用 ＡｒｃＧＩＳ １０.８ 软件绘制甘草各居
依据相关文献资料(陈士林等ꎬ２０１３)ꎬ本研究 群单倍型地理分布图ꎻ利用 ＧｅｎＡＬＥｘ ６.５０３ 软件对
选取在遗传多样性和谱系地理学研究中应用较多 甘草居群的地理距离和遗传距离进行 Ｍａｎｔｅｌ 相关
的 ７ 对 通 用 引 物 进 行 筛 选ꎬ 分 别 为 ＩＴＳ、 ｍａｔＫ、 性分析ꎮ
ｒｂｃＬ、ｐｓｂＡ－ｔｒｎＨ、ｔｒｎＳ －ｔｒｎＧ、ｒｐｓ１６、ｔｒｎＬ－ｔｒｎＦꎬ引物
由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成ꎮ 随机 ２ 结果与分析
选取不同省( 区) ２ 个甘草样本进行扩增ꎬＰＣＲ 扩

增反应体系的总体积为 ２５ μＬꎬ包含 ＤＮＡ 模板 １ ２.１ ＩＴＳ 与 ｃｐＤＮＡ 序列特征
２＋
μＬ、正反引物各 ０.５ μＬ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ( 含 Ｍｇ ) 对所有甘草样本的 ＩＴＳ、ｍａｔＫ、ｐｓｂＡ － ｔｒｎＨ 和
￣１
２.５ μＬ、２.５ ｍｍｏｌＬ ｄＮＴＰｓ ０.５ μＬ、ｄｄＨ Ｏ １９.５ ｔｒｎＳ－ｔｒｎＧ 的 片 段 分 别 进 行 测 序 和 比 对ꎬ 并 利 用
２
μＬ、５ ＵμＬ Ｔａｑ 酶 ０.５ μＬꎮ 反应程序为 ９５ ℃ 预 Ｅｄｉｔｓｅｑ 软件计算序列的 ＧＣ 含量( 表 ３)ꎮ 结果得
￣１
变性 ５ ｍｉｎꎻ９５ ℃ 变性 ５ ｍｉｎꎬ５５ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 到 ９８ 条 ＩＴＳ 序列ꎬ平均长度为 ６９１ ｂｐꎬ包含 ６０５ 个
延伸 ４０ ｓꎬ３５ 个循环ꎻ７２ ℃ 再延伸 ７ ｍｉｎꎮ 扩增产 保守位点、６３ 个变异位点、６ 个简约信息位点ꎬ平

物经 １％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测ꎬ 发 现 ＩＴＳ、 ｍａｔＫ、 均 ＧＣ 含 量 为 ５４. ４３％ꎻ对 ｍａｔＫ ( ８６２ ｂｐ)、 ｐｓｂＡ －
ｐｓｂＡ－ｔｒｎＨ 和 ｔｒｎＳ－ｔｒｎＧ ４ 对引物可扩增出单一稳 ｔｒｎＨ(３５６ ｂｐ)、ｔｒｎＳ－ｔｒｎＧ(７５８ ｂｐ)进行拼接后得到
定、清晰明亮的条带ꎬ用于后续实验ꎮ 序列信息见 ９６ 条 ｃｐＤＮＡ 序列ꎬ比对排列后的长度为 １ ９７６ ｂｐꎬ
表 ２ꎮ ＰＣＲ 扩增产物送至南京派森诺基因科技有 共包含 ９２６ 个保守位点、７４０ 个变异位点、４１８ 个

限公司进行测序ꎮ 简约信息位点ꎬ平均 ＧＣ 含量为 ２８.５１％ꎮ
１.４ 数据分析 ２.２ 甘草居群单倍型信息
利用 ＣＥｘｐｒｅｓｓ 软件对序列进行手动拼接校对ꎻ 利用 ＤｎａＳＰ ５.０ 软件对不同甘草居群单倍型