Page 77 - 《广西植物》2025年第4期

４ 期 覃先玉等: 增补无性系对湿地松种子园遗传多样性的影响 ６ ９ １

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西壮族自治区南宁市武鸣区( １０８°００′ Ｅ、２３°１０′ ｄＮＴＰｓ(含 Ｍｇ 浓度 １０ ｍｍｏｌＬ )(上海捷瑞生物
Ｎ)ꎬ属南亚热带南缘季风性气候区ꎬ年均气温 ２１.５ 工程 有 限 公 司 )、 上 下 游 引 物 各 ０. ２５ μＬ ( １０
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℃ ꎬ年均 降 水 量 １ ２４６ ｍｍꎬ 年 均 蒸 发 量 １ ６１３. ８ ｍｍｏｌＬ )、０.０７ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ (５ Ｕ
ｍｍꎬ全年无霜期 ３５８ ｄꎬ干湿季节变化明显ꎬ平均 μＬ )(上海捷瑞生物工程有限公司)及 ６.２３ μＬ 的
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相对湿度约 ７９％ꎬ种子园建在石灰岩峰林峰丛间 ｄｄＨ Ｏꎮ 该扩增反应在梯度 ＰＣＲ 仪(ＴＡｄｖａｎｃｅｄ ９６
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宽阔的缓丘台地带ꎬ海拔高约 １２０ ｍꎬ土壤为赤红 Ｇ)上完成ꎬＳＳＲ￣ＰＣＲ 扩增的程序:９４ ℃ 预变性 ４
壤ꎬｐＨ 为 ５.５ ~ ６.５ꎬ土层深厚(周洋ꎬ２０２０)ꎮ ｍｉｎꎬ９４ ℃ 变性 １５ ｓꎬ５６ ℃ 复变性 １５ ｓꎬ７２ ℃ 延伸
该种子园建设于 １９９０ 年ꎬ初期配置 １８ 个无性 ３０ ｓꎬ３０ 个循环ꎻ７２ ℃ 延伸 ２０ ｍｉｎꎬ１２ ℃ 保存ꎮ
系ꎮ 该园是广西湿地松最主要产种基地和杂交试 用 ８％聚丙烯酰胺凝胶电泳对 ＰＣＲ 扩增后的产
验基地ꎮ ２００６ 年至今ꎬ广西壮族自治区林业科学 物进行分离ꎬ方法是 １０ μＬ 体系中加入 ７ μＬ Ｌｏａｄｉｎｇ
研究所已连续 １６ 年在该园开展湿地松种内、种间 Ｂｕｆｆｅｒꎬ用 １０ μＬ 移液枪吸取 ７ μＬ 混合液注入胶孔
杂交试验ꎬ创制杂交组合上千份ꎬ并在园中选育林 中ꎬ２２０ Ｖ 电泳直至指示剂跑至超过 ２ / ３ 胶面后停
木新品种 １ 个ꎬ审定林木良种 ２ 个ꎮ 建园无性系过 止ꎬ电泳结束后对凝胶进行固定、银染、显影ꎬ直至
少ꎬ既限制了所产种子的遗传多样性ꎬ也限制杂交 出现清晰条带ꎬ并拍照保存(李辉等ꎬ２０２３)ꎮ
试验的亲本选择范围ꎮ 为解决这一问题ꎬ研究团 １.５ 数据统计和分析
队从 ２０１０ 年开始在广西区内外湿地松遗传测定 对扩增产物条带进行人工判读ꎬ按条带长度
和采脂林分中进行新一轮的优树选择ꎮ 为避免近 从大 到 小 进 行 编 号ꎮ 汇 总 后 使 用 在 线 程 序
交ꎬ此次选择范围不包括该种子园的子代林分ꎮ ＣＥＲＶＵＳ ３.０７ 计算每个基因座的多态信息含量
２０１５ 年ꎬ根据新选择的无性系在收集圃内的表现ꎬ ( ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ＰＩＣ )ꎬ 并 通 过
从中选出 ３２ 个增补无性系入园ꎬ将建园无性系总 Ｐｏｐｇｅｎｅ １.３２ 软件计算观测等位基因数(ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
量扩增至 ５０ 个(表 １)ꎮ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｌｌｅｌｅｓꎬＮ )、有效等位基因数( ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｏ
１.２ 试验材料 ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｌｌｅｌｅｓꎬ Ｎ )、 观 测 杂 合 度 ( ｏｂｓｅｒｖｅｄ
ｅ
在种子园内采集 ５０ 个无性系针叶样各一份 ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ Ｈ ) 和 Ｓｈａｎｎｏｎ 指 数 ( Ｓｈａｎｎｏｎ ’ ｓ
ｏ
(表 ２)ꎬ采样时选择无病虫害的新鲜针叶ꎬ按无性 ｉｎｄｅｘꎬＩ)ꎻ利用 ＮＴＳＹＳ ２.１０ 软件构建 ＵＰＧＭＡ 聚
系的编号分别装入自封袋中ꎬ并在自封袋上做好 类图ꎮ 通过 ＰＩＣ ＣＡＬＣ 软件计算 ＰＩＣ 值(Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ
标记ꎬ采样后放入－８０ ℃ 中保存备用ꎮ ａｌ.ꎬ１９８０)ꎮ ＰＩＣ 值指多态信息含量ꎬ是判断 ＳＳＲ
１.３ 湿地松基因组 ＤＮＡ 的提取与检测 引物多态性的重要指标ꎬ当 ＰＩＣ≤０.２５ 时ꎬ该位点
采用北京百奥创新科技有限公司( ＢｉｏＦｌｕｘ) 生 为低度多态性位点ꎻ当 ０.２５<ＰＩＣ≤０.５ 时ꎬ该位点
产的 Ｂｉｏｓｐｉｎ 全能型植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒 为中度多态性位点ꎻ当 ＰＩＣ>０.５ 时ꎬ该位点为高度
提取针叶的总 ＤＮＡꎬ分光光度计测量浓度约为 ２５ 多态性位点ꎮ 引物的有效扩增率指能够有效扩增
￣１ 的引物数量与引物总数量的比值ꎻ引物的多态性
ｎｇμＬ ꎬ后置于－２０ ℃ 冰箱保存备用ꎮ
１.４ ＳＳＲ￣ＰＣＲ 扩增和产物检测 比率指具有能够有效扩增且多态性的引物数量与
本文利用团队对湿地松针叶转录组( 周洋ꎬ 引物总数量的比值ꎮ
２０２０)测序组装得到的 ＥＳＴ 序列进行 ＳＳＲ 位点信 １.６ ＤＮＡ 指纹图谱的构建

息筛选ꎬ选择条件:ＳＳＲ 序列长度范围 为 １２ ~ ３０ 参考杨树( 刘超凡等ꎬ２０２１) 和华山松无性系
ｂｐꎬ２ 个碱基单元的重复 ６ 次以上ꎬ３ 个和 ４ 个碱基 (曹正英等ꎬ２０２４)指纹图谱的方法构建湿地松无
单元的重复次数为 ５ 次和 ３ 次ꎬ对以上基因序列进 性系指纹图谱ꎬ用于鉴定的各 ＳＳＲ 引物以固定顺

行标记开发ꎮ 设定目的扩增产物长度为 ５０ ~ ５００ 序依次用字母 Ａ、Ｂ、ＣＬ 表示(因字母 Ｉ 和数字
ｂｐꎬ上、下游引物长度为 １８ ~ ２２ ｂｐ 且退火温度差 １ 相似而排除)ꎬ各湿地松无性系在每对引物上的
不超过 ３ ℃ ꎮ 共开发了 １３６ 对 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物用于 等位基因类型用“ / ” 连接ꎬ只记录数字ꎬ如果没有

筛选ꎬ交由广州艾基生物有限公司进行引物合成ꎮ 位点则用 ０００ 表示ꎮ 经不同引物扩增后ꎬ无性系
湿地松 ＳＳＲ￣ＰＣＲ 采用 １０ μＬ 体系:２ μＬ ＤＮＡ 将得到由字母和数字组成的一串编号ꎬ作为唯一
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(２５ ｎｇμＬ )、１ μＬ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ( １０ ×)、０. ２ μＬ 识别的 ＳＳＲ 指纹图谱代码ꎮ