Page 133 - 《广西植物》2025年第7期
P. 133
７ 期 刘文珍等: 地钱 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因克隆及基因敲除突变体构建 １ ３ ２ ５
用价值ꎮ 与其他植物相比ꎬＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ 在地钱这 以其为材料ꎬ因此本研究以 Ｔａｋ１ 为材料ꎬ用南京
种新兴的模式植物中研究较少ꎬ但已开发了一系列 诺唯赞生物科技股份有限公司的植物总 ＲＮＡ 提
高效的 ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ 地钱基因组编辑载体ꎬ这些载 取试剂盒提取地钱总 ＲＮＡꎮ 以地钱总 ＲＮＡ 为模
体能高效地进行地钱基因组编辑 ( Ｓｕｇａｎｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ 板ꎬ使用反转录试剂盒进行反转录得到 ｃＤＮＡꎮ 使
２０１８)ꎬ这为我们利用基因编辑技术来探究地钱 用 Ｔａｋａｒａ 公司的高保真酶进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ
ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因的功能带来了可能性ꎮ １.３.２ 生物信息学分析 利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ( ｈｔｔｐｓ: / /
本研究以新兴模式植物地钱为材料ꎬ采用生 ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 分 析 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋 白
物信息学、实时荧光定量 ＰＣＲ 和 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 技 的理 化 性 质ꎻ 利 用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ.
术等方法ꎬ拟探讨以下问题:(１) ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋白 ｏｒｇ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / )分析 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋白的亲疏水性ꎻ
的理化性质与结构分析ꎻ(２) ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因系统 利用 ＳＯＭＰＡ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｎｐｓａ. ｌｙｏｎ. ｉｎｓｅｒｍ. ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ /
进化 关 系 及 ＰＰ２Ａ￣Ａ 保 守 性 预 测 分 析ꎻ ( ３ ) ｎｐｓａ＿ ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ / ＮＰＳＡ / ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ)
ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基 因 启 动 子 活 性 预 测 分 析ꎻ ( ４ ) 预测 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋 白 的 二 级 结 构ꎻ 利 用 ＳＷＩＳＳ￣
ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因 在 地 钱 中 特 异 性 表 达 分 析ꎻ ( ５) ＭＯＤＥＬ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ) 进 行
ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因缺失突变体的表型分析ꎮ 通过对 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋 白 三 级 结 构 预 测 分 析ꎻ 利 用
ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因的初步研究ꎬ本研究挖掘 ＰＰ２Ａ￣Ａ ＴＭＨＭＭ￣２. ０ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ. ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ. ｄｔｕ. ｄｋ /
的基本功能ꎬ为进一步研究 ＰＰ２Ａ 调控植物生长发 ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ￣２.０ / )预测 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋白跨膜
育的分子机理奠定基础ꎮ 结 构 域ꎻ 利 用 ＳｉｇｎａｌＰ￣６.０ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ.
ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅ / ＳｉｇｎａｌＰ￣６.０ / ) 预 测
１ 材料与方法 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋 白 信 号 肽ꎻ 利 用 ＳＭＡＲＴ ( ｈｔｔｐ: / /
ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ.ｄｅ / )预测 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋白功能结构域ꎻ
１.１ 材料 利用 ＭＥＧＡ １１ 构建 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因核苷酸进化
野生型雄性地钱 Ｔａｋ１ 由湖南工业大学百合种 树ꎻ利用 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ 进行 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因启动子活
质资源创新与深加工湖南省工程研究中心提供ꎻ 性分析ꎻ利用 ＴＢｔｏｏｌｓ 对启动子活性分析结果进行
ＲＮＡ 提取试剂盒和第一链 ｃＤＮＡ 合成试剂盒均购 可视化ꎮ
自南 京 诺 唯 赞 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司ꎻ ｑＰＣＲ￣ １.３.３ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 的表达量检测 以生长 ２０ ｄ 左右
ＰｒｅＭｉｘ 购自 Ｒｏｃｈｅ 有限责任公司ꎻ琼脂糖和核酸 的野生型地钱 Ｔａｋ１ 为材料ꎬ分别取其 顶 端 缺 口
染料购自 生 工 生 物 工 程 ( 上 海) 股 份 有 限 公 司ꎻ 处、胞芽杯、叶状体 ３ 个部位ꎬ按照植物 ＲＮＡ 提取
ＴＭ ＴＭ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ 购自赛默飞世尔 试剂盒的说明书ꎬ提取各部位的 ＲＮＡꎮ 电泳检测
Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ
科技(中国)有限公司(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ꎮ ＲＮＡ 的质量及完整性ꎬ按照 ｃＤＮＡ 第一链合成试
１.２ 引物设计 剂盒说明书进行反转录ꎮ 因为地钱 ＭｐＡＰＴ３ 基因
利用 ＳｎａｐＧｅｎｅ 进行引物设计ꎮ 其中 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 在地钱各个部位的表达量稳定ꎬ以它作为内参基
基因的克隆引物为 ＭｐＰＰ２Ａ￣ＣＤＳ￣Ｆ/ ＭｐＰＰ２Ａ￣ＣＤＳ￣ 因ꎬ用 Ｒｏｃｈｅ 荧光定量 ＰＣＲ 试剂进行实时荧光定
ＲꎻＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因荧光定量 ＰＣＲ 引物为 ＭｐＰＰ２Ａ￣ 量 ＰＣＲꎬ分析地钱不同部位 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因的表
ｑＰＣＲ￣Ｆ/ ＭｐＰＰ２Ａ￣ｑＰＣＲ￣Ｒꎻ 内 参 基 因 的 引 物 为 达量ꎮ
ＭｐＡＰＴ３￣ｑＰＣＲ￣Ｆ/ ＭｐＡＰＴ３￣ｑＰＣＲ￣Ｒꎻ 敲 除 载 体 １. ３. ４ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 敲 除 突 变 体 的 构 建 根 据
ｓｇＲＮＡ 的序列为 Ｏｌｉｇｏ１ 和 Ｏｌｉｇｏ２ꎻ敲除载体阳性克 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 系统设计原则ꎬ通过 ＣＲＩＳＰＲ 设计网
隆鉴定的引物为 ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣１￣Ｆ/ Ｍ１３Ｒꎻ转基因 站( ｈｔｔｐ: / / ｃｒｉｓｐｒ. ｈｚａｕ. ｅｄｕ. ｃｎ / ＣＲＩＳＰＲ２ / ) 在 靠 近
阳性苗 ＰＣＲ 鉴 定 和 测 序 的 引 物 分 别 为 Ｃａｓ９￣Ｆ/ 起始密码子 ＡＴＧ 位置选择打靶序列ꎬ在 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ
Ｃａｓ９￣Ｒ 及 ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣１２￣ｊｃ￣Ｆ/ ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣１２￣ 基因 １ 号外显子上设计 １ 条 ｓｇＲＮＡ 序列ꎬ设计的
ｊｃ￣Ｒꎮ 引物的具体序列信息见表 １ꎮ ｓｇＲＮＡ 序列为 ＧＴＡＣＡＣＡＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＧＧꎬＰＡＭ
１.３ 方法 为 ＣＧＧꎬ并在正义链和反义链分别添加接头ꎬ便于
１.３.１ 基因克隆 雄性地钱 Ｔａｋ１ 植株在遗传上相 构建载体ꎮ 靶序列为 Ｏｌｉｇｏ１(５′￣ｇｃａｃｃｃａｇｃｃｔｃｔｃｇＧＴＡ
对较为稳定ꎬ并且前人在地钱叶状体转化中主要 ＣＡＣＡＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＧＧｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａ￣３′)和 Ｏｌｉｇｏ２
